Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, Poliovirus-Isolate mithilfe eines einfachen Protokolls schnell zu identifizieren. Für diesen Test verwenden wir sensibilisierte Gelatinepartikel, die mit chimären Molekülen beschichtet sind und die die extrazelluläre Domäne des humanen Poliovirusrezeptors verbunden mit IgG2-Fc enthalten. Da diese Partikel eine einheitliche Affinität zu allen Serotypen von Poliovirus-Isolaten aufweisen, tritt eine Agglutination der Partikel nach Inkubation mit Proben ein, die irgendein humanes Poliovirus enthalten.

Wenn jedoch Antikörper vorhanden sind, die in der Lage sind, das spezifische Virus im Probenmaterial zu erkennen, tritt eine Neutralisation auf, die in diesem experimentellen System die Agglutination verhindert, wodurch eine schnelle Identifizierung von Poliovirus-Isolaten in einer einzigen Reaktionsschritt ermöglicht wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren, wie dem konventionellen Neutralisationstest, ist die Einfachheit der Prozedur und der Auswertung, wodurch der Arbeitsaufwand verringert und die Zeit bis zur Ergebnisvorlage verkürzt wird. Um die Anti-PV-eins-, PV-zwei- und PV-drei-Antikörper wiederherzustellen, geben Sie 0,5 Milliliter Wasser zu jedem Fläschchen hinzu.

Überführen Sie dann jede Antikörperlösung in separate Röhrchen mit jeweils 4,5 Milliliter Wartungsmedium. Einige Chargen des Anti-PV-Antikörpers liegen bereits rekonstituiert vor; für solche Chargen des Anti-PV-Antikörpers ist die Zugabe von Wasser zur Rekonstitution nicht erforderlich.

Bereiten Sie anschließend Eintropfmischungen der kombinierten Antikörperlösung mit einem Endvolumen von 3,6 Millilitern in frischen beschrifteten Röhrchen vor. Mischen Sie beispielsweise 1,8 Milliliter Anti-PV eins mit 1,8 Milliliter Anti-PV zwei. Um eine Kombination aus Anti-PV eins und PV zwei herzustellen, wiederholen Sie dies für jede mögliche paarweise Kombination und bereiten Sie außerdem eine Lösung vor, die alle drei Antikörpertypen enthält, indem Sie jeweils 1,2 Milliliter der drei Antiseren miteinander mischen.

Nachdem die vier Mischungen hergestellt wurden, werden jeweils 720 Mikroliter FCS zu jeder Antikörperlösung gegeben. Dies trägt dazu bei, die unspezifische Agglutination von Gelatinepartikeln durch Antikörper während des Nachweises zu verringern. Die Antikörperpools können bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie im Agglutinationstest verwendet werden.

In diesem Assay verwenden wir lyophilisierte Gelatinepartikel, die mit den extrazellulären Domänen des menschlichen Poliovirusrezeptors und IgG zwei einer mausartigen FC-Domäne beschichtet wurden. Verwenden Sie zur Sicherstellung der Konsistenz des Agglutinationsbildes unbedingt eine einzige Charge von Partikeln und nicht verschiedene Chargen innerhalb eines Experiments. Rekonstituieren Sie die Partikel durch Zugabe von 1,5 Milliliter Rekonstitutionspuffer zu jedem Vial. Vorsichtig klopfen, um gut zu mischen.

Die rekonstituierten Partikel können bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius gelagert werden. Gestalten Sie zunächst Ihr Experiment in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte. Für jede Probe enthält die Vertiefung Nummer eins ausschließlich Virus.

Die Vertiefungen zwei bis fünf enthalten das Virus sowie jeweils eine der vier Antikörper-Mischlösungen. Achten Sie darauf, eine Vertiefung für eine negative Kontrolle freizuhalten, die nur Medium, jedoch kein Virus und keine Antikörper enthält. Nachdem die Platte vorbereitet wurde, geben Sie 12 µL der entsprechenden Antikörperlösung in jede Vertiefung der Reihen zwei bis fünf sowie 12 µL Wachstumsmedium hinzu.

Mittel zum Virus allein, Vertiefungen in Reihe eins und zur Negativkontrolle in Reihe sechs. Als Nächstes 12 Mikroliter Virusprobe in die ersten fünf Reihen und 12 Mikroliter Wachstumsmedium in die Negativkontrollvertiefung in Reihe sechs hinzufügen. Sobald die Antikörper und das Virus ausgeplattet wurden, das rekonstituierte Gelatinepartikel durch vorsichtiges Antippen suspendieren und unverzüglich 25 Mikroliter Partikel pro Vertiefung in alle Vertiefungen geben.

Es ist wichtig, die Partikel vor dem Übertragen in die Platte nicht sedimentieren zu lassen, um in jeder Vertiefung gleiche Mengen an Partikeln zu erhalten. Stellen Sie die Testplatte auf einen Plattenmischer und mischen Sie 30 Sekunden lang. Danach stellen Sie die Platte auf ein Blatt weißes Papier und inkubieren sie zwei Stunden bei Raumtemperatur, um eine Agglutination zu ermöglichen.

Es ist wichtig, die Platte während oder nach der Inkubation nicht zu bewegen, da die gebildete Agglutination instabil ist. Sobald die Reaktion abgelaufen ist, machen Sie mehrere Aufnahmen der Platte, auf denen die Qualität der Agglutination in jedem Well beurteilt werden kann. In Wells, in denen keine Agglutination stattgefunden hat, wie hier links gezeigt, setzen sich die gefärbten Gelatinepartikel am Boden des Wells ab, während sie sich in Wells mit Agglutination verteilen.

Aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Virus und den mit IgG zwei A beschichteten Gelatinepartikeln ist ein diffuses Farbmuster sichtbar, wie in der Mitte dargestellt. In diesem Experiment untersuchten wir die Fähigkeit von Viruslösungen, PV eins, zwei und drei, Agglutination in Gegenwart des Antikörpers hervorzurufen. Kombinationen, wie hier gezeigt, in Abwesenheit von Virus oder Antikörpern, führen zu keiner Agglutination, und die Gelatinepartikel sedimentieren. Im Gegensatz dazu, in Vertiefungen mit Virus, aber ohne Antikörper.

Es kam zur Agglutination aufgrund der Wechselwirkung des Virus. Bei den PVR-IgG-zwei-A-bedeckten Gelatinepartikeln in den Versuchsgefäßen wird die Agglutination der Viren in jedem Gefäß verhindert, das Antikörper enthält, die das Virus spezifisch neutralisieren. Beispielsweise wird die Agglutination des Poliovirus Typ eins in Gefäßen mit Anti-PV-eins-Antikörpern verhindert, jedoch nicht in Gefäßen, die nur Anti-PV-zwei- und Anti-PV-drei-Antikörper enthalten.

Dasselbe gilt für Poliovirus-Typen zwei und drei. Sobald man die Methode beherrscht, kann sie in nur drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.