ReAsH / Flash Labeling und Bildanalyse von Tetracysteinmotiv Sensor Proteinen in Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen, die ein tetra-cystein- und fluoreszenzmarkiertes Protein exprimieren, mit den Farbstoffen Flash oder Ash zu markieren und die Ergebnisse quantitativ zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plasmid, das ein fluoreszierendes Protein und das Zielprotein mit einem Tetra-Cystein-Tag trägt, in die gewünschte Zelllinie transfiziert wird. Anschließend wird das exprimierte Protein mit R oder Flash markiert, und die unspezifisch gebundenen Farbstoffe werden durch Waschen mit BAL entfernt, um die Probe für die mikroskopische Bildgebung vorzubereiten.

Anschließend wird ein konfokales Mikroskop verwendet, um fluoreszierende Aufnahmen der Zellen mit den ash- oder flash- und Fluoreszenzprotein-Kanälen zu erfassen. Abschließend werden die Bilder mithilfe von ImageJ analysiert, um die Bindung von ash oder flash an das Zielprotein zu quantifizieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Ausmaß der Bindung von ash oder flash an das Zielprotein in Zellen anhand der Korrelation zwischen der Fluoreszenz von ash und der Fluoreszenz des Fluoreszenzproteins veranschaulichen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der einfachen Markierung des Zielproteins mit GFP, liegt darin, dass sie es ermöglicht, eine zweite Eigenschaft des Proteins zu verfolgen, beispielsweise konformationelle Veränderungen zusätzlich zu dessen Lokalisation. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Protein-Substruktur und -funktion zu beantworten, wie beispielsweise Lokalisierungsereignisse, konformationelle Veränderungen und LI-Bindungsereignisse, die die Fähigkeit des TAC beeinflussen, ban ash oder flash zu binden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir untersuchen wollten, wie sich kleine submikroskopische polygame Aggregate von Met-Huntington in Zellen bilden.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Datenanalyse aufgrund ihrer technischen Komplexität schwer zu erlernen sind. Die experimentellen Verfahren werden gezeigt. Schritt eins bis drei wird von Yasmin Ranson, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, durchgeführt, die die Datenanalyse demonstriert. Schritt vier wird von Sevki GaN, einem Doktoranden aus unserem Labor, durchgeführt, unter Verwendung standardmäßiger Zellkulturmethode für Ihre Zelllinie und einer mit lebenden Zellen befüllten Bildgebungskammer, die für die Transfektion vorbereitet ist.

Bereiten Sie eine Kultur adhärenter Zellen vor und transfizieren Sie das Plasmid, das das gewünschte TC-Tag-Gen enthält. Je nach gewählter Transfektionsmethode ist es wichtig, positive und negative Kontrollen einzusetzen, um das Ausmaß der spezifischen Bindung an die TC-Tags beurteilen zu können sowie einen Farbüberlauf (Bleach-Fluss) zwischen den Kanälen bei der Aufnahme von konfokalen Mikroaufnahmen ausschließen zu können. Stellen Sie daher bei zweifarbiger Detektion sicher, dass Proben mit jeweils nur einer Farbe vorbereitet werden, entweder das fluoreszierende Protein allein oder, falls möglich, ein Tctech-Protein, das an Fleisch oder vs. gebunden ist.

Aber ohne ein fluoreszierendes Protein. Ein bis zwei Tage nach der Transfektion die Zellen vorsichtig mit 300 Mikrolitern vorgewärmter Hank’s abgeglichener Salzlösung oder HBSS spülen, frische vorgewärmte HBSS mit 10 Mikromolar, einem, zwei, et Ethan Dithiol oder EDT und einem Mikromolar Flash oder Ash vorbereiten. Nach dem Entfernen der HBSS von den Zellen diese vorsichtig durch 300 Mikroliter des Ash-Mediums ersetzen und genau 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Zellkulturinkubator inkubieren.

Unserer Erfahrung nach erhöhen längere Inkubationszeiten die Hintergrundfluoreszenz signifikant. Entfernen Sie die Markierungslösung vorsichtig durch Absaugen und ersetzen Sie sie durch 300 µL vorgewärmtes HBSS mit 250 µM TwoThreeDimer, CapPropanol oder BAL für 15 Minuten bei 37 °C. Entfernen Sie die Waschlösung durch vorsichtiges Absaugen und ersetzen Sie sie durch 300 µL vorgewärmtes HBSS.

Nach dieser Waschung können die Zellen mit Paraform fixiert werden, wobei wir festgestellt haben, dass dies die unspezifische zynische Fluoreszenz erhöht. Daher bilden wir die Zellen normalerweise lebend bei Raumtemperatur ab. Außerdem verhindert die Fixierung der Zellen vor der Markierung die Bindung des Bial-Farbstoffs.

Um die Bildaufnahme von Zellen am konfokalen Mikroskop zu beginnen, legen Sie die Parameter für die Bildaufnahme der einzelnen Fluorophore fest und stellen Sie sicher, dass die Übersprechen zwischen den Kanälen vernachlässigbar ist. Anschließend passen Sie die Einstellungen des Photomultipliers so an, dass die maximale Fluoreszenz in der Probe den Detektor nicht übersteuert. Sobald die optimalen Bildaufnahmeeinstellungen ermittelt sind, ändern Sie keine dieser Einstellungen mehr zwischen den Proben.

Verwenden Sie eine Abtastrate von 200 Hertz, erfassen Sie vier Zeilenmittelwerte und stellen Sie den Lochdurchmesser auf eine Flächeneinheit ein. Der Lochdurchmesser kann vergrößert werden, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis ein Problem darstellt. Dies kann jedoch zu einem gewissen Verlust an Abbildungsauflösung führen.

Sammeln Sie die konfokalen Bilder im 12-Bit- oder höheren Format, wenn möglich. Um die Qualität der quantitativen Datenanalyse zu maximieren. Sammeln Sie Bilder für den fluoreszierenden Protein-Kanal und auch für den BI-Arsenal-Farbstoff-Kanal für alle Proben.

Um die Daten zu analysieren, verwenden Sie die Image-J-Software mit den folgenden Plugins. Wenn Sie eine Version von Image J verwenden, die älter ist als Version 1.32 C, klicken Sie auf die folgenden Optionen. Um mehrere Bilder gleichzeitig öffnen zu können, bearbeiten Sie die Optionen Eingabe geteilt durch Ausgabe und aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um den j-Datei-Chooser zum Öffnen geteilt durch Freigeben zu verwenden.

Klicken Sie auf „Okay“. Öffnen Sie die Bilder von Interesse. Image J definiert automatisch die maximalen und minimalen Pixelintensitäten, die für jedes Bild einzeln auf dem Bildschirm angezeigt werden, da verschiedene Bilder unterschiedliche Pixelintensitäten aufweisen können.

Das bedeutet, dass die angezeigten Bilder beim Betrachten nicht vergleichbar sind. Um sicherzustellen, dass die geöffneten Bilder alle denselben Maßstab aufweisen, definieren Sie physisch die oberen und unteren Pixelintensitäten, die angezeigt werden sollen. Um diese Werte festzulegen, wählen Sie das Bild aus und passen Sie Helligkeit/Skontrast an.

Klicken Sie auf „Setzen“, definieren Sie die minimalen und maximalen angezeigten Werte. Wählen Sie anschließend „Auf alle geöffneten Bilder übertragen“ und klicken Sie auf „OK“. Alternativ können Sie alle Bilder eines bestimmten Kanals in einer einzigen Datei oder einem Stapel zusammenführen.

Image J passt anschließend automatisch alle Bilder an denselben Maßstab an. Wählen Sie dazu Bildstapel Bilder zu Stapel hinzufügen, geben Sie einen für jede Datei gemeinsamen Namen ein und aktivieren Sie Titel als Beschriftungen verwenden. Klicken Sie auf OK.

Wandeln Sie alle geöffneten Bilder zur Analyse in 8 Bit um. Durch die Auswahl des Bildtyps 8 Bit wird der angezeigte Bereich auf ein Intervall von null bis 255 umskaliert. Es ist wichtig, nicht im ursprünglichen 12-Bit- oder höheren Format zu speichern, da sonst Informationsinhalte verloren gehen.

Speichern Sie eine Kopie in einem neuen Ordner mit dem Namen „eight bit converted“ mithilfe der Option „Speichern unter“. Eine Methode, um den Umfang der Biarsal-Dye-Bindung in einem gesamten Bild zu untersuchen, besteht darin, ein Korrelationsdiagramm der Pixelintensität anzufertigen. Dieses Diagramm stellt jeden Pixelwert eines Kanals relativ zum entsprechenden Pixelwert eines zweiten Kanals dar.

Daher entspricht eine hohe Position im Pixelwert der GFP-Fluoreszenz auch einer hohen Position in der Asch-Fluoreszenz bei starker Bindung. Um die Pixel-Korrelation zu analysieren, stellen Sie sicher, dass die 8-Bit-REA- und GFP-Bilder in ImageJ geöffnet sind. Öffnen Sie anschließend das Image Correlator-Plugin, indem Sie Plugins → Image Correlator auswählen. Weisen Sie die Bilddateien Bild eins und Bild zwei zu.

Dann klicken Sie auf „OK“. Der resultierende Stapel zeigt möglicherweise keine detaillierten Informationen an. Dies ist normal.

Speichern Sie den Stack in einem neuen Ordner mit dem Namen Streudiagramme und geben Sie ihm denselben Dateinamen wie die Probe, auf die er sich bezieht. Zum Beispiel Ash GFP-Korrelationsdiagramm. Um die Daten anzusehen, wählen Sie eine von zwei Optionen.

Zunächst transformieren Sie die Daten, indem Sie „Prozessieren“ → „Mathematik“ → „Log“ → „Automatisch“ wählen, sodass sie im Logarithmusformat vorliegen. Anschließend skalieren Sie die Daten visuell, indem Sie auf „Bild“ → „Helligkeit/Kontrast“ klicken und „Automatisch“ auswählen. Danach skalieren Sie die Daten visuell erneut, um nur niedrige Werte anzuzeigen, und stellen die Daten mithilfe einer speziellen Nachschlagetabelle (LUT) dar, um eine benutzerdefinierte LUT zu erstellen.

Klicken Sie auf die Bildfarbbearbeitung LUT für eine sehr einfache LUT. Klicken Sie auf das obere linke Pixel und wählen Sie die Farbe Schwarz. Wählen Sie dann das nächste Pixel rechts daneben und wählen Sie die Farbe Rot.

Klicken Sie anschließend auf das dritte Pixel und ziehen Sie bei gedrückter Maustaste die Auswahl bis zum unteren rechten Pixel. Wählen Sie die Farbe Rot aus, klicken Sie auf „OK“ und anschließend auf die Farbe Weiß, dann erneut auf „OK“. Wählen Sie den Helligkeits-/Kontrastbereich von null bis 255, wie zuvor beschrieben, um das Bild entsprechend dem Bildschirmabbild festzulegen.

Konvertieren Sie das Bild in das RGB-Format, um es in andere Programme kopieren und einfügen zu können. Öffnen Sie zunächst die 8-Bit- oder 16-Bit-Bilder wie zuvor beschrieben. Weisen Sie den Bildern ein LUT-Farbschema für GFP zu.

Weisen Sie die grüne LUT durch Klicken auf das Bild zu. Suchen Sie die grünen Look-up-Tabellen. Wählen Sie abschließend das zu kopierende Bild aus und kopieren Sie es in die Zwischenablage, indem Sie „Bearbeiten“ und „In System zwischenspeichern“ auswählen. Diese Abbildung zeigt ein typisches Ergebnis für die Kinase Sock, die mit GFP und einem TC-Tag fusioniert ist und 30 Minuten lang angefärbt wurde.

Bei der Verwendung von ASH in HEC 2 9 3-Zellen scheint ASH effizient mit dem Zielprotein, das einen TC-Tag trägt, mit hoher Affinität zu binden. Im Gegensatz dazu zeigt diese Abbildung die entsprechende Kontrollprobe von SARK, das mit GFP fusioniert ist, aber den TC-Tag fehlt, was für die Überprüfung sowohl der Spezifität des TC-Tags als auch des Hintergrundanfärbungsgrads unerlässlich ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass RH keine Reaktivität mit dem Zielprotein aufweist, das den TC-Tag fehlt, was auf die Spezifität des TC-Tags für die SSH-Bindung hinweist.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Zellen nicht konfluent und ruhend werden, da dies die V-Bindung in den Zellen beeinträchtigen würde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Daten einfach quantitativ analysieren können, und Sie können diese Methoden verfeinern, um Ihre eigene einzigartige IUTS für die Datenvisualisierung zu entwickeln.