Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein dreidimensionales humanes Hautrekonstrukt für Untersuchungen zur Biologie von Melanozyten, Melanomen und Hautstammzellen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Insert von Gewebekulturschalen mit neutralisiertem bovinem Kollagen beschichtet wird. Im zweiten Schritt wird der zelluläre dermale Kompartiment aus Fibroblasten und Kollagen hergestellt.

Anschließend wird das epidermale Kompartiment aus Keratinozyten, gemischt mit Melanozyten oder Melanomzellen, hergestellt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, am Tag 18 ein Hautrekonstrukt zu gewinnen und dieses auf eine Maus zu transplantieren. Letztendlich zeigen immunhistochemische und immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen des Transplantats die Architektur normaler Haut mit Melanozyten, die Migration und Differenzierung normaler Stammzellen sowie stadienspezifische Melanomphänotypen.

Wir haben das Hautrekonstruktionsmodell vor 20 Jahren entwickelt, weil wir bereits zu Beginn unserer Studien feststellten, dass normale Melanozyten oder Melanomzellen, die in einer Petrischale kultiviert werden, sich sehr unterschiedlich verhalten als Zellen im Gewebekontext. Daher eignet sich das Hautrekonstruktionsmodell ideal dafür, zu beobachten, wie Zellen von einem Kompartiment der Haut in ein anderes wandern. Die zuvor vorbereitete azelluläre Kollagenmischung auf Eis, und anschließend fügt man ein Milliliter der strohgelben Lösung in jedes Insert eines Sechsloch-Systems ein.

Die Gewebekulturplatte inkubieren, indem die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur gestellt wird, damit das Gel erstarren kann. Während dieser Zeit sollte sich die Farbe der Lösung von gelb nach rosa verändern, während das Gel erstarrt. Trypsin-Augen, humane Fibroblasten aus ihrem Kulturgefäß mit 0,25 % Trypsin-EDTA nach fünf Minuten. DMEM mit 10 % FBS hinzufügen, um den Neutralisierungsprozess abzuschließen.

Sammeln Sie die abgelösten Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten lang bei 200 ×g bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie die Zellen anschließend mit 4,5 × 10⁵ Zellen pro 1,5 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Füllen Sie als Nächstes ein 50-Milliliter-Gefäß mit der zuvor hergestellten Kollagenmischung der Zellschicht und stellen Sie das Gefäß auf Eis.

Geben Sie 1,5 Milliliter der Fibroblastensuspension zu dem Röhrchen hinzu und mischen Sie gut. Geben Sie drei Milliliter der strohgelben zellulären Schichtlösung auf jeden mit akzellulärer Schicht beschichteten Insert. Anschließend inkubieren Sie die Gewebekulturplatte 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid während der Inkubationszeit.

Die Farbe der zellulären Schichtlösung sollte sich ebenfalls von gelb nach rosa verändern. Nachdem sich das obere Gelschicht verfestigt hat, geben Sie zwei Milliliter DMEM mit 10 % FBS auf die Innenseite des Inserts in der Gewebekulturplatte und zehn Milliliter auf die Außenseite des Inserts. Inkubieren Sie die Gewebekulturplatten vier Tage lang.

Am vierten Tag überprüfen, ob sich das Gel zusammenzieht; am vierten Tag der Inkubation das Medium sowohl vom Inneren als auch vom Äußeren jedes Inserts abpipettieren. Zwei Milliliter Waschmedium in das Innere und 10 Milliliter in das Äußere der Inserts geben, um das normale Serum abzuwaschen. Anschließend die Platten eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Epidermis zu bilden.

Zunächst wird Trypsin bei humanen Keratinozyten verwendet. Danach, nach fünf Minuten, verwenden Sie Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen, um das Trypsin zu neutralisieren, nachdem die abgelösten Zellen fünf Minuten lang bei 200 ×g zentrifugiert wurden. Resuspendieren Sie das Zellpellet anschließend in Haut bei 4,17 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.

Rekonstruieren Sie das Medium, nachdem die Keratinozyten gewonnen wurden. Belichten Sie humane Melanozyten mit Trypsin auf Eis für ein bis zwei Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin erneut mit Trypsininhibitor aus Sojabohnen.

Anschließend die Zellen erneut unter denselben Bedingungen wie zuvor zentrifugieren und das Melanozyten-Pellet in Haut-Rekonstruktionsmedium 1 auf eine Konzentration von 8,3 × 10⁵ Zellen pro Milliliter resuspendieren. Danach das Spülmedium sowohl vom Innen- als auch vom Außenraum jedes Inserts einer vorbereiteten Gewebekulturplatte mit Dermalschicht entfernen.

Ersetzen Sie das Waschmedium, indem Sie 1,5 Milliliter Hautrekonstruktionsmedium eins auf die Innenseite und 10 Milliliter auf die Außenseite jedes Inserts geben. Anschließend mischen Sie 600 Mikroliter der Keratinozyten-Zellsuspension mit 600 Mikrolitern der Melanozyten-Suspension. Geben Sie 200 Mikroliter der gemischten Zellsuspension ab.

Tropfen für Tropfen auf die Innenseite jedes Inserts geben. Die Zellkulturplatte zwei Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation das Hautrekonstruktionsmedium eins aus der Innenseite und der Außenseite jedes Inserts absaugen und anschließend zwei Milliliter Hautrekonstruktionsmedium zwei auf die Innenseite sowie 10 Milliliter auf die Außenseite des Inserts geben.

Danach inkubieren Sie die Rekonstrukte weitere zwei Tage bei 37 Grad Celsius. Nach der zweiten zweitägigen Inkubation aspirations das Hautrekonstruktionsmedium zwei von der Innenseite und Außenseite jedes Inserts. Geben Sie nun 7,5 Milliliter des Hautrekonstruktionsmediums drei nur auf die Außenseite der Inserts.

Stellen Sie die Rekonstrukte zurück in den Inkubator und wechseln Sie die Haut. Erneuern Sie das Rekonstruktionsmedium alle zwei Tage, bis zum Tag 18. Am Tag 18 der Inkubation aspirieren Sie das Medium von der Innenseite und Außenseite der Inserts einer mit Hautrekonstrukten beladenen Gewebekulturplatte.

Entfernen Sie die Inserts aus der Schale mit einer Pinzette. Schneiden Sie das Konstrukt einschließlich des Polycarbonatfilters aus, indem Sie mit einer Rasierklinge einen Kreis nahe der Kante nachzeichnen. Legen Sie danach das rekonstruierte Gewebe im Filter auf eine harte Unterlage und halbieren Sie es mit der Klinge.

Legen Sie eine Hälfte des Rekonstruktionspräparats auf ein schwarzes TBS-Biopsiepapier und geben Sie das Papier anschließend in ein Histologiekassette. Tauchen Sie die gesamte Kassette mehr als vier Stunden lang in 10 % Formalin ein. Anschließend stellen Sie die Kassette in 70 % Ethanol und lagern sie bei vier Grad Celsius, bis Sie bereit sind, das Rekonstruktionspräparat für die Paraffineinbettung zu verarbeiten.

Platzieren Sie die andere Hälfte des Rekonstrukts in 50 % Saccharose bei vier Grad Celsius für eine bis zwei Stunden. Danach wechseln Sie die Saccharose auf zwei molare Konzentration und lagern das Präparat weitere eine bis zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Füllen Sie eine Basismatrize zur Hälfte mit optimalem Schneidetemperatur-Medium (OCT) oder einem ähnlichen Einfriermedium.

Vermeiden Sie jegliche Blasenbildung. Greifen Sie den Rand des Rekonstruats mit einer Pinzette und entfernen Sie den Rekonstruat aus der Saccharoselösung. Legen Sie ihn auf Kim-Tücher, bis die Saccharose vollständig absorbiert ist.

Überführen Sie das Rekonstrukt mithilfe einer Pinzette und eines Spatels in das Boot auf die Oberseite des OCT. Bedecken Sie die Oberseite des Rekonstrukts mit weiterem OCT, bis das Boot vollständig gefüllt ist. Vermeiden Sie erneut Blasen.

Stellen Sie das Boot gleichmäßig auf zerkleinertes Trockeneis, damit das OCT vollständig gefriert. Anschließend wickeln Sie die Basisform samt Folie ein und lagern sie bei minus 70 Grad Celsius, bis Sie bereit sind, sie mit einem Kryostaten zu schneiden. Um die Transplantation eines Hautrekonstruktats auf eine Maus vorzubereiten, füllen Sie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff und geben fünf Milliliter DMEM in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Füllen Sie einen Becher mit 600 Milliliter Leitungswasser und stellen Sie den Becher zur Erwärmung auf ein Heizgerät. Wählen Sie anschließend eine weibliche skid haarlose, nicht inzüchtete Maus mit einem Alter von etwa sechs Wochen. Nach der Anästhesie der Maus mit Isofluran.

Verwenden Sie eine Nasenkappe, um die Anästhesie während des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten. Tragen Sie einen sterilen Augenschmiermittel auf und gewährleisten Sie Wärmeunterstützung, um eine Hypothermie zu verhindern. Reinigen Sie anschließend die Haut des Mäuses mit Benzoinlösung und alkoholischen Desinfektionstupfern.

Markieren Sie eine Linie auf dem Rücken der Maus, um die gleiche Position für die spätere Naht zu gewährleisten. Schneiden Sie mit einer Iris-Schere und Pinzette eine runde Wundfläche auf dem Rücken der Maus aus und bedecken Sie anschließend die Wundfläche mit sterilen Gazetupfern. Legen Sie die runde Maushaut in das 50-Milliliter-Röhrchen mit DMEM.

Tauchen Sie das Röhrchen in einen flüssigen Stickstoffbehälter, bis das gesamte Medium und das Gewebe vollständig eingefroren sind. Anschließend tauen Sie das Röhrchen in einem Becher mit heißem Wasser vollständig auf. Wiederholen Sie diesen Einfrier- und Auftauvorgang dreimal.

Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um ein Hautrekonstrukt von einem Insert zu lösen. Entfernen Sie die Membran äußerst vorsichtig und übertragen Sie anschließend das Hautrekonstrukt auf das Wundbett der Maus. Legen Sie nun die Maushaut auf das Hautrekonstrukt.

Stellen Sie sicher, dass die erste Naht über der zuvor markierten Markierung liegt und die zweite darunter. Verwenden Sie dann zwei weitere Nähte an den Seiten der Hautrekonstruktion, um die Maushaut zu fixieren. Reinigen Sie die Maushaut nach der Transplantation und setzen Sie die Maus anschließend in einen neuen Käfig.

Am Tag 18. Die Epidermis der Hautrekonstrukte besteht aus geschichteten Keratinozytenschichten, wobei die undifferenzierte basale Schicht und darauf folgende differenzierte Schichten vertikal orientiert sind. Färbung des Schnitts der Rekonstrukte mit dem melanocytären Marker.

S 100, wie durch die schwarzen Pfeile angezeigt, zeigt, dass Melanozyten in der Basalschicht der Epidermis ausgerichtet sind und über dendritische Fortsätze mit mehreren Keratinozyten kommunizieren. Der dermale Kompartiment enthält Fibroblasten, die in einer Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet sind; abgelagertes Kollagen IV weist auf die Basalmembran hin, die die Epidermis vom Dermis trennt. Die folgenden Abbildungen veranschaulichen, wie mehrere Schichten von Keratinozyten in der Epidermis gebildet werden.

Wenn dermale Stammzellen, die mit einem GFP-Lentiviralvektor markiert wurden, gemeinsam mit Fibroblasten in eine Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet werden, wandern sie bis zum fünften Tag in die Epidermis ein und differenzieren sich zu Melanozyten. Nach dem Ansäen von Keratinozyten beginnen einzelne Zellen, sich von den Sphäroiden auszuwachsen.

Beachten Sie, dass die Epidermis weiterhin aus einer einzigen Schicht besteht. Am achten Tag. Einige Zellen erreichen die Grenzfläche zwischen Epidermis und Dermis.

Am Tag 10 sind die GFP-positiven Zellen, wie hier zu sehen ist, dicht am Basalmembran-Position ausgerichtet. In die Epidermis migrierte GFP-positive Zellen exprimieren den melanozytären Marker HMB 45. Wenn verschiedene Stadien von Melanomzelllinien in Hautrekonstrukte eingebaut werden, spiegelt das Verhalten der Zellen ihre in-vivo-Eigenschaften wider.

Hier sind normale Melanozyten und Melanomzellen, die in 2D-Kulturen gezüchtet wurden, in dieser Abbildung zu sehen. Die Lokalisation und das Wachstum von normalen Melanozyten sind in Hautrekonstrukten eng kontrolliert, wie hier zu sehen ist; primäre Melanome im radialen Wachstumsstadium proliferieren vorwiegend in der Epidermis, während Melanome im vertikalen Wachstumsstadium invasiv in die Dermis wachsen, wie in dieser Abbildung dargestellt. Schließlich ist hier erkennbar, wie metastatische Melanome aggressiv tief in die Dermis eindringen.

Unsere Studien an normaler Haut bilden die Grundlage für ein besseres Verständnis der Entstehung und Progression von Melanomen.