Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, die Selbstorganisation gesunder Hirnaktivität in neuronale Lawinen zu untersuchen, die das Kennzeichen kritischer Zustandsdynamiken in der Großhirnrinde darstellen. Dies wird erreicht, indem ein koronarer Schnitt der geschichteten Großhirnrinde mit einem Mittelhirnschnitt kombiniert wird, der entwicklungsbedeutsame dopaminerge Eingaben an die Großhirnrinde liefert. Als zweiter Schritt wird die Kokultur aus Großhirnrinde und Mittelhirn auf einem Multielektrodenarray kultiviert, das eine multizentrische Stimulation und Aufzeichnung neuronaler Aktivitäten in der Kultur ermöglicht.

Anschließend lassen wir die Kokultur während der ersten ein bis zwei Wochen in einem speziell konstruierten Inkubator abflachen, sich ausdehnen und an der MEA-Oberfläche anheften, wobei die Kultur periodisch normaler Luft und Kulturmedium ausgesetzt wird. Es werden flüssige Ergebnisse erhalten, die die spontane Selbstorganisation räumlich-zeitlicher Ausschläge des lokalen Feldpotentials in neuronale Lawinen zeigen. Die Grundlage bilden MEA-Aufzeichnungen und eine Offline-Analyse der Lawinen, die das Potenzgesetz in den Größen der Lawinen identifiziert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dissoziierten Kulturen, liegt in ihrem systemischen, neurowissenschaftlichen Aspekt. Wir können viele Hirnregionen gemeinsam kultivieren, und diese Kulturen aus mehreren Regionen bilden eine Hirnorganisation, die auf großer Skala korrekt ist, beispielsweise hinsichtlich kortikaler Schichten und Projektionssysteme. Die Anwendungen dieser Technik reichen über die Untersuchung neuronaler Lawinen hinaus.

Beispielsweise können wir die Reizantwort auf Netzwerkebene unter genau kontrollierten In-vitro-Bedingungen untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das korrekte Auftragen der Plasma-Thrombin-Mischung und das Positionieren des Gewebes auf der MEA schwer zu erlernen sind. Diese Schritte erfordern einen geeigneten Zeitpunkt, das richtige Temperaturgefälle und vermeiden, die empfindliche MEA-Oberfläche direkt zu berühren.

Um eine sterile, verschließbare Glaswanne für die Ableitungen vorzubereiten, schneiden Sie zunächst gewindeförmige Glaszylinder mit einem Teflonkunststoffdeckel etwa zwei Millimeter unterhalb des Gewindes ab. Diese werden benötigt, um die Kulturwanne sicher und dicht zu verschließen. Anschließend reinigen Sie die Glaskolben, indem Sie sie dreimal mit Wasser spülen und dann fünf Minuten lang in absolutem Ethylalkohol kochen.

Stellen Sie diese beiseite, um sie zu trocknen; eine Silikonlösung ist erforderlich, um die Glasringe an der MEA-Oberfläche zu befestigen. Verwenden Sie ein Cell Guard 180 4 Silikon-Elastomer-Kit und mischen Sie 15 Milliliter der Komponenten A und B gründlich. Anschließend 15 Minuten ruhen lassen, um Luftblasen zu entfernen.

Trennen Sie die Lösung in ein Milliliter Eloqua ab und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verwendung. Kleben Sie nun einen Glasring auf die MEA, indem Sie ein Milliliter Silikon bei 23 Grad Celsius mit einer Spritze und einer Nadel mit kleinem Durchmesser aufnehmen und auf die unpolierte Schnittfläche des Glasrings auftragen. Zentrieren Sie dann den Glasring auf der MEA und tragen Sie eine zusätzliche Schicht Silikon außen um den Ring herum auf, um eine stärkere Abdichtung zu erzielen.

Lassen Sie dies für eine bis zwei Stunden bei etwa 60 Grad Celsius auf einem Heizblock aushärten. Anschließend sterilisieren Sie die MEA-Kammer und die Kammerdeckel unter dem laminaren Luftstrom, indem Sie sie dreimal mit entionisiertem Wasser und danach dreimal mit 70 %igem Alkohol spülen, wobei der letzte Spülgang mit Alkohol erfolgt. Lassen Sie die Kammer 10 Minuten im Alkohol stehen.

Im Anschluss die Kammer und das Innere des Deckels 10 Minuten lang UV-Licht aussetzen. Bei 120 Grad Celsius 45 Minuten lang autoklavieren. Nach der Sterilisation diese trocknen lassen.

Bestreichen Sie nun die MEA-Oberfläche innerhalb der Kulturkammer mit Poly-D-Lysin. Neue MEAs, wie sie in diesem Experiment verwendet werden, sind eher lipophil, daher mehrfaches Auftragen von Tropfen erforderlich. Absaugen der Lösung vom Elektrodengitter.

Befestigen Sie die Kappe, um die MEA-Kammer zur Lagerung und zukünftigen Verwendung abzudichten. Dieses Verfahren ergibt Cortex- und VTA-Schnitte für etwa 12 Co-Kulturen und sollte innerhalb eines laminaren Luftstromgehäuses unter sterilen Bedingungen mit gesunden ein- bis zweitägigen nachgeborenen Tieren durchgeführt werden; die Gesamtzeit für die Gewebegewinnung sollte weniger als eine Stunde betragen. Beginnen Sie nach der Enthauptung mit der Entnahme des Gehirns, indem Sie zunächst zwei seitliche Schnitte mit der Schere ausführen, um die Haut von der Kopfhaut zu entfernen.

Entfernen Sie den Schädel und öffnen Sie ihn mit einer feinen Augenscheren, indem Sie einen sagittalen Median- und einen koronalen Schnitt am Übergang zwischen Kortex und Kleinhirn anlegen. Klappen Sie die vier Schädelflächen zurück, um das Gehirn freizulegen. Schneiden Sie anschließend mit einem geschärften Spatel frontal durch den Riechkolben.

Dann bewegen Sie den Spatel viertelweise unter das Gehirn. Heben Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel und lassen Sie es in gekühlte Gaze gleiten. Lösung zur schnellen Abkühlung und vorübergehenden Lagerung.

Wiederholen Sie das obige Verfahren für zwei weitere Gehirne. Um VTA-Gewebe zu erhalten, überführen Sie die Gehirne auf eine sterile, trockene Petrischale. Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie jedes Gehirn etwa einen Zentimeter seitlich verschieben.

Entfernen Sie dann mit einem Rasierklinge den Hirnstamm, indem Sie einen koronalen vertikalen Schnitt auf Höhe des Kleinhirns durchführen. Kleben Sie nun einen Agarblock auf eine Montagescheibe, um die Gehirne während des Schneidens mechanisch zu stabilisieren. Bringen Sie anschließend mit einem kleinen Spatel einen dünnen Strich Sekundenkleber einige Millimeter vor dem Agarblock auf der Scheibe an, wobei darauf zu achten ist, dass der Kleber den Agarblock nicht berührt.

Übertragen und montieren Sie jedes Gehirn mit der Frontalpole nach unten. Stellen Sie sicher, dass die Frontalpole auf der Montagescheibe befestigt sind und die ventralen Seiten die Agarose berühren, ohne dass Klebstoffrückstände vorhanden sind. Dies gewährleistet eine geeignete mechanische Stabilisierung während des Schneidens und eine einfache Entnahme der geschnittenen Schnitte.

Danach tauchen Sie die Montagescheibe mit den darauf befestigten Gehirnen vorsichtig ein und sichern sie in einer Vibram-Schale, die mit gekühlter Gaze-Lösung gefüllt ist. Anschließend schneiden Sie mit einer sorgfältig gereinigten Rasierklinge 400 Mikrometer dicke koronare Schnitte des Mittelhirns bei höchster Vibrationsfrequenz und relativ niedriger Vorschubgeschwindigkeit. Sammeln und überführen Sie die Schnitte, die das VTA enthalten, mithilfe einer umgedrehten Pasteur-Pipette mit Saugbirne in 35 × 10 Millimeter große Petrischalen, die mit steriler, gekühlter Gaze-Lösung für kortikale Schnitte gefüllt sind. Wiederholen Sie die vorherigen Schrittschneidenschritte, führen Sie jedoch einen vertikalen Schnitt zwischen Kortex und Kleinhirn durch und befestigen Sie die vier Gehirne mit der Frontalpole nach oben.

Sammeln Sie etwa drei koronale Schnitte mit einer Dicke von 350 Mikrometern, beginnend auf der Ebene des Striatums. Verwenden Sie nun ein Mikromesser aus gebrochenen Rasierklingen, um unter einem Stereomikroskop etwa zwei Millimeter breite koronale Abschnitte des frontalen Kortex und von Mittelhirnarealen, die die VTA enthalten, zu dissezieren. Sammeln Sie die Gewebeschnitte getrennt in kleinen Schalen, die mit gekühlter Gaze-Lösung gefüllt sind.

Um mit dem Montieren des Gewebes in der MEA-Kammer zu beginnen, positionieren Sie zunächst die MEA bei Raumtemperatur unter einem Stereomikroskop, sodass das Elektrodenarray scharf gestellt ist. Anschließend bringen Sie einen 25-Mikroliter-Tropfen Plasma mittig auf der sauberen, staubfreien und sterilen Matrix des Elektrodenarrays auf. Mit einem kleinen Spatel schieben Sie vorsichtig einen Cortex- und VTA-Abschnitt in den Plasma-Tropfen.

Platzieren Sie nun die MEA auf einer Kühlplatte und stellen Sie die Ansicht erneut scharf. Lassen Sie dies etwa 15 Sekunden lang abkühlen, bevor Sie 25 Mikroliter Thrombin in den Plasmatropfen geben. Verteilen Sie dann mit der Thrombin-Pipettenspitze vorsichtig die Plasmathrombin-Mischung durch kleine kreisförmige Bewegungen über die MEA.

Vermeiden Sie es sorgfältig, die spröde Elektrodenanordnung direkt zu berühren. Positionieren Sie anschließend vorsichtig den Kortex auf der Anordnung, wobei die dorsale Begrenzung entlang der zweiten Elektrodenreihe liegen sollte. Auf diese Weise werden die sich entwickelnden oberflächlichen Schichten schließlich den restlichen Teil der Anordnung bedecken.

Platzieren Sie dann die VTA benachbart zur ventralen Grenze des kortikalen Schnitts. Verschließen Sie nun die MEA-Kammer und schließen Sie sie locker, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu bewahren. Lassen Sie die MEA-Kulturvorrichtung etwa sechs Minuten lang bei Raumtemperatur im Sicherheitswerkbankgehäuse stehen, damit das Plasma-Thrombin gerinnt und koaguliert.

Unterdessen wiederholen Sie den Vorgang, um drei weitere Kulturen vorzubereiten. Fügen Sie anschließend mit einer 1-cc-Spritze und einer 25 × 5/8-Zoll-Nadel vorsichtig in kleinen Tropfen 600 Mikroliter Kulturmedium zu den Kulturkammern hinzu. Schließen Sie danach die MEA-Kammer fest und stellen Sie die MEA-Kulturanordnung auf das schwenkbare Lageregister im Inneren des Inkubators.

Nach zwei Tagen in vitro 10 Mikroliter Mitoseinhibitor hinzufügen. Anschließend erneuern Sie das Kulturmedium zu 60 % nach vier Tagen in vitro und danach alle vier Tage. Während des normalen Wachstums wird sich die Kultur deutlich abflachen und leicht dorsal expandieren.

Aufgrund der Entwicklung oberflächlicher kortikaler Schichten zeichnet sich eine gesunde Kultur im Hellfeld durch ihr undurchsichtiges, grauliches Gewebe aus. Umgekehrt weisen helle, reflektierende Vesikel, ein Merkmal absterbender, degenerativer Zellen, etwa 10 bis 12 Tage nach der Herstellung der Kulturen darauf hin, dass diese zum Aufzeichnen und Stimulieren bereit sind. Um eine Aufnahmesitzung zu beginnen, wird die MEA von der Lagertasche auf die Aufzeichnungs-Headstage übertragen.

Um das lokale Feldpotential (LFP) aufzuzeichnen, verwenden Sie einen Bandpassfilter von eins bis 200 Hertz. Multieinheitenaktivität kann ebenfalls mit einem Bandpassfilter von 300 bis 3000 Hertz untersucht werden. Gesunde spontane Aktivität tritt typischerweise in Bursts unterschiedlicher Größe und Dauer auf.

Um die Beziehung zwischen LFP und Einzelzellaktivität zu untersuchen, können wir die aus Spikes ausgelösten Mittelwerte des LFP berechnen. Bei diesen Kortexkulturen korrelieren negative LFP-Ausschläge mit neuronalem Spiking, um stimulusinduzierte Aktivität aufzuzeichnen. Zunächst werden die zeitliche Wellenform und die Amplitude der Reize mittels einer Software festgelegt, die einen Stimulansgenerator steuert.

Ein nützliches Stimulationsparadigma ist der stromgesteuerte, ladungsneutrale Einzelimpuls mit bipolarem Rechteckverlauf. Anschließend wird eine Elektrode ausgewählt, die zur Applikation der Reize verwendet wird. Typische, durch den Reiz hervorgerufene LFP-Antworten ähneln spontanen Aktivitätsausbrüchen.

Die Blankingschaltung trennt die Verstärker während der Stimulation, um Stimulationsartefakte zu verringern und eine Sättigung der Verstärker zu verhindern. Die Stimulations-Elektrode benötigt mehrere Sekunden, um sich von der Stimulation zu erholen, und kann daher nicht zur Aufzeichnung der Antwortaktivität verwendet werden. Auf der MEA treten Aktivitäten tendenziell in räumlich-zeitlichen Clustern auf, wobei die Aktivität an einer Elektrode oft von Aktivitäten an anderen Stellen begleitet wird.

Gleichzeitig werden hier typische Wellenformen des LFP während solcher Aktivitätsphasen gezeigt, indem drei Cluster, die jeweils mehrere Sekunden auseinanderliegen, übereinander gelegt werden. Negative LFP-Ausschläge sind an mehreren Elektroden innerhalb eines Zeitfensters von einer Sekunde erkennbar, wenn NLFP-Peaks extrahiert werden, die einen Schwellenwert aus mehreren negativen Standardabweichungen (sd) überschreiten. Die Aktivität in Form von NLFP-Peak-Zeiten lässt sich zweckmäßigerweise in einem Rasta darstellen, bei dem Spalten von Punkten nahezu gleichzeitige NPS an verschiedenen Elektroden repräsentieren. Die räumlich-zeitliche Organisation dieser Aktivität ist recht komplex.

Spalten, die bei niedriger zeitlicher Auflösung mehr oder weniger homogen erscheinen, bestehen bei höherer zeitlicher Auflösung aus separaten Clustern und so weiter. Das Entstehen von räumlichen, geotemporalen und LFP-Clustern ist in kortikalen Netzwerken hochgradig organisiert. Genauer gesagt ist die Organisation skaleninvariant für neuronale Lawinen.

Dies wird durch die Berechnung der Wahrscheinlichkeit von Clustern in einer bestimmten zeitlichen Auflösung veranschaulicht. Delta T. Hier bestehen die Cluster aus NL-FPS, die im selben oder aufeinanderfolgenden Zeitintervallen auftreten. Wenn die Größe eines solchen Clusters als Gesamtanzahl der NFPS pro Cluster oder als integrierte NLFP-Amplituden pro Cluster ausgedrückt wird, zeigt die Verteilung der Clustergrößen ein Potenzgesetz mit einem Exponenten nahe minus 1,5. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirngewebe vorsichtig präpariert und Kulturen auf Multielektrodenarrays züchtet, um die Selbstorganisation neuronaler Aktivität zu untersuchen.

Mit diesen Methoden wurde außerdem der Zusammenhang zwischen spontaner Aktivität und stimulusinduzierter Aktivität in kortikalen Netzwerken untersucht.