Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genexpression in den neuronalen Vorläuferzellen des embryonalen zentralen Nervensystems zu verändern. Dies wird erreicht, indem zunächst zeitlich befruchtete Weibchen beschafft und auf eine Operation vorbereitet werden. Anschließend werden die Uterushörner durch einen Bauchschnitt freigelegt.

Nachdem die Embryonen freigelegt sind, wird DNA in das Seitenventrikel, den dritten Ventrikel oder den subretinalen Raum injiziert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, über die Uteruswand hindurch einen elektrischen Strom durch den Embryo zu leiten, wobei die Elektrodenpaddel so ausgerichtet werden, dass die positive Elektrode über der bevorzugten Transfektionsstelle platziert ist. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie die Proliferation, Migration und Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen in der tline kelon dying kelon und der Retina zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Degeneration transgener Mäuse, liegt in ihrer Schnelligkeit, der Möglichkeit, Hochdurchsatz-Studien durchzuführen, und ihren geringeren Kosten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neuronalen Entwicklung zu beantworten, beispielsweise, welche Gene die Regulation von neuronalen Vorläuferzellen, der Zellproliferation, der Zellschicksalsbestimmung, der neuronalen Differenzierung und der Zellmigration steuern. Die Auswirkungen dieser Technik könnten sich auf ein besseres Verständnis der genetischen Signalwege erstrecken, die zugrunde liegende Defekte in der Entwicklung des zentralen Nervensystems erklären, von denen viele zu kognitiven Beeinträchtigungen und Verhaltensstörungen beim Menschen führen. Über ihre Nützlichkeit hinaus, die Entwicklung des zentralen Nervensystems zu verstehen,

Diese Technik kann auch auf andere Organsysteme angewendet werden, wie beispielsweise das sich entwickelnde periphere Nervensystem, das Herz und die Plazenta. Sie eignet sich ebenfalls zur Untersuchung von Krankheitsmodellen bei Mäusen sowie bei anderen Modellorganismen wie Huhn und Xip. Im Allgemeinen ist die primäre Hürde für den Erfolg bei Personen, die neu in dieser Technik sind, das Überleben der Embryonen. Es muss sorgfältig vorgegangen werden, während der Manipulation, Injektion und beim Gießen der Embryonen.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir ein schnelles Verfahren zur Manipulation der Genexpression im embryonalen Telencephalon und in der Netzhaut benötigten. Wir entwickelten diese Technik in unserem Labor, indem wir die ursprünglich von Sal beschriebene und 2001 in der Fachzeitschrift Developmental Biology veröffentlichte Methode modifizierten. Außerdem arbeiteten wir mit einem Crash-Labor zusammen, um dieses Protokoll auch im sich entwickelnden Dilon zu etablieren.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Injektions- und Elektroporations­schritte schwer zu erlernen sind, weil sie eine sehr sorgfältige Handhabung der Embryonen erfordern und die Injektionsstellen manchmal sehr klein sein können. Beispiel: der subretinale Raum. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert heute Rajiv, ein Postdoktorand aus dem Labor von Sherman. Zunächst sämtliche chirurgischen Instrumente reinigen und sterilisieren. Danach Spritzen mit Kochsalzlösung und Ringer-Laktat-Lösung füllen und im Operationsbereich auf eine Heizplatte stellen, um sie aufzuwärmen.

Desinfizieren Sie eine Heizplatte mit 70 % Ethanol und bedecken Sie sie anschließend mit einem sterilisierten, fusselfreien Gazetupfer. Stellen Sie die Heizplatte auf 37 Grad Celsius ein. Legen Sie das Tier in eine kleine Narkosekammer und führen Sie 5 % Isofluran mit Sauerstoff mit einer Rate von einem Liter pro Minute über einen Verdampfer zu, um es zu anästhesieren.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Isofluran-Fluorausatemluft mithilfe eines Absaugsystems sammeln. Sobald die Atmung des Tieres tief und regelmäßig ist, nehmen Sie es aus der Kammer heraus. Verwenden Sie dazu die Zehenquetschung und den Augenblinzreflex.

Um eine vollständige Anästhesie sicherzustellen. Legen Sie das anästhesierte Tier auf den Bauch und verwenden Sie eine Beatmungssonde, um während der Operation 2,25 % Fluoran unter Zufuhr von Sauerstoff zuzuführen. Injizieren Sie Buprenorphin subkutan am Hinterhaupt des Nackens in einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht.

Überwachen Sie weiterhin die Atmung des Tieres und passen Sie gegebenenfalls den Fluss von Isofluran an. Befestigen Sie dann ein Klebeband über der Brust des anästhetisierten Tieres und überprüfen Sie erneut die Reaktion auf Reizung, indem Sie mit einer stumpfen Pinzette in die Hinterpfote zwicken. Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen eine dicke Schicht der Creme auf den Bauch auf, wobei sichergestellt werden muss, dass das Unterfell vollständig bedeckt ist.

Lassen Sie die Creme etwa drei Minuten einwirken und überprüfen Sie in unregelmäßigen Abständen die Haarentfernung. Befeuchten Sie mit einem sterilen Tupfer ein steriles Mulltuch mit steriler Wasser und entfernen Sie die Haare vom Abdomen. Anschließend desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Chlorhexidin und zusätzlichem Wasser.

Trocknen Sie den Bauch mit sauberer, steriler Gaze ab. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 70 % Ethanol unter Verwendung frischer, sterilisierter Baumwollgaze. Bereiten Sie die Operation vor, indem Sie chirurgische Kleidung anlegen, um die Uterushörner freizulegen.

Zunächst die Linea alba als schwache Linie unter der Haut entlang der Mittellinie lokalisieren. Mit einer Pinzette die Haut von der Bauchwand wegziehen und mit einer Hautschere unter Verwendung von gebogenen Pinzetten und Scheren einen kleinen geraden Schnitt von der mittleren Bauchregion nach unten durchführen. Den Vorgang mit dem Peritoneum wiederholen. Das Peritoneum mit der Pinzette fassen.

Ziehen Sie die Bauchdecke zurück und schneiden Sie einen nur so großen Einschnitt, dass die Gebärmutter hindurchgezogen werden kann. Legen Sie eine sterile Gaze mit einem kleinen vertikalen Schlitz über den Einschnitt und befeuchten Sie sie mit warmer, steriler Kochsalzlösung. Führen Sie danach die Pinzette in den Einschnitt ein und ertasten Sie die Gebärmutter, wobei Sie den Einschnitt mit der Pinzette offenhalten.

Greifen Sie die Gebärmutter zwischen dem ersten und zweiten sichtbaren Embryo und ziehen Sie beide Seiten der Uterushörner auf die Gaze. Zählen Sie die Anzahl der Embryonen und notieren Sie eventuelle Resorptionen oder Embryonen mit geringer Körperform. Um die korrekte Anzahl an DNA-Injektionen vorzubereiten, befeuchten Sie die Uterushörner mit Kochsalzlösung und bringen Sie vorsichtig ein Uterushorn zurück in die Bauchhöhle.

Um die chirurgischen Nadeln zu füllen, verwenden Sie eine gezogene, pastetteartige Pipette mit angeschlossenem Mundstück, um 10 Mikroliter einer Lösung mit drei Milligramm pro Milliliter aufzuziehen. Füllen Sie die endotoxinfreie DNA-Lösung, die Methylgrün-Farbstoff enthält, in die chirurgische Nadel ab. Befestigen Sie die erste gefüllte Nadel am Mikromanipulator.

Beginnen Sie mit dem Embryo, der der Ovarie am nächsten liegt, und stellen Sie den mit dem Injektor verbundenen Ständer auf. Drehen Sie den Embryo vorsichtig mithilfe einer Rundpinzette innerhalb der Decidua, sodass er mit dem Gesicht nach vorne liegt, um Injektionen in Richtung von der ROS-Rolle zur Chorda durchführen zu können. Nutzen Sie eine faseroptische Lichtquelle, um die Mittellinie des embryonalen Gehirns zu identifizieren.

Beachten Sie die beidseits gelegenen großen Seitenventrikel in den rostralen Regionen. Halten Sie das Embryo mit einer gebogenen Pinzette fest und positionieren Sie die gefüllte Operationsnadel über dem Uterus, sodass der Eindringwinkel in das Gehirn etwa 45 Grad beträgt. Drehen Sie mit einer schnellen, gleichmäßigen Bewegung das Rad am Mikromanipulator, um die Nadelspitze durch die Uteruswand hindurch in den Seitenventrikel des embryonalen Gehirns einzuführen.

Als Nächstes drücken Sie die Fußplatte des Mikroinjektors. Um die DNA-Lösung zu injizieren, ist eine erfolgreiche Injektion leicht zu erkennen, da sich der Methylengrün-Farbstoff in den Ventrikeln des embryonalen Gehirns ausbreitet. Nachdem die DNA injiziert wurde, ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um sie zu entfernen, ohne eine Beschädigung zu verursachen.

Legen Sie das injizierte Embryo auf die sterile Gaze und benetzen Sie es gründlich mit warmer Kochsalzlösung. Greifen Sie den Uterus mit der positiven Elektrode der Paddel-Elektrode, die über der gewünschten Transfektionsstelle platziert ist. Geben Sie dann fünf rechteckige elektrische Impulse von 40 bis 50 Volt und 50 Millisekunden Dauer mit einer Frequenz von einem Impuls pro Sekunde ab.

Decken Sie das injizierte und elektroporierte Embryo mit schützender, feuchter Gaze ab und fahren Sie anschließend mit der Injektion des nächsten Embryos fort. Nach Abschluss der Injektion und Elektroporation aller gewünschten Embryonen im Uterushorn schieben Sie dieses vorsichtig zurück in die Körperhöhle. Entfernen Sie das zweite Uterushorn, um mit der Injektion und Elektroporation der verbleibenden Embryonen zu beginnen.

Nachdem alle Embryonen wieder in der Gebärmutter liegen, zwei bis drei Milliliter warme Kochsalzlösung in die Bauchhöhle geben und dann die Gaze aus dem Bauchraum entfernen, um die Seiten des Peritoneums freizulegen. Das Peritoneum mit schwarzem chirurgischem Seidenfaden vernähen, wobei der Faden am Peritoneum nahe dem Sternum verankert wird und anschließend die Naht vom Verankerungspunkt weggeführt wird. Sicherstellen, dass alle Nähte fest sitzen und dass keine darunterliegenden Organe oder die Haut in das Peritoneum eingenäht werden.

Schneiden Sie die restliche Nahtlinie ab und entsorgen Sie sie. Schließen Sie die Haut über der Nahtstelle mit Hautheftklammern unter Verwendung einer Pinzette. Heften Sie die Haut ab, wobei darauf geachtet werden muss, die darunterliegende Nahtstelle nicht zu klammern oder die Haut zu straff zu ziehen.

Nach Beendigung sicherstellen, dass die Klammern fest sitzen, indem man hier vorsichtig mit dem Nahtwerkzeug zusammendrückt, A-P-C-I-G. Zwei Expressionsvektoren, die die Expression von GFP steuern, wurden mittels Elektroporation in die sich entwickelnde Neokortexregion am Tag E 12 eingeführt. Während die Neokortexentwicklung fortschreitet, differenzieren sich die apikalen Vorläuferzellen entweder in sekundäre basale Vorläuferzellen oder in postmitotische Neuronen und exprimieren weiterhin GFP. Anschließend können diese neuronalen Zellen auf die Expression typischer Marker des neuronalen Subtyps, dargestellt in Rot, analysiert werden.

In dieser venalen Ansicht eines Vorderhirns eines Embryos, der am Tag E 12 elektroporiert und am Tag E 14 präpariert wurde, wird die Elektroporationsstelle durch die grüne Epi-Fluoreszenz am Tag E 14 angezeigt. Die GFP-Expression ist im Thalamus, Präthalamus und Hypothalamus sichtbar, was darauf hinweist, dass die Zielgebiete erfolgreich transfiziert wurden. Der gestrichelte Kasten markiert die Lage des Schnitts durch eine ventrikuläre Zone.

Ein genauerer Blick auf die ventrikuläre Zone zeigt die Migration von GFP-Zellen aus der ventrikulären Zone in die Mantelzone. Wo sich hypothalamische Kerne bilden, ist auch die embryonale Retina leicht elektroporierbar, wie in diesem koronaren Schnitt durch ein E16,5-Embryo gezeigt, das bei E15,5 mit PCIC elektroporiert wurde. Hier ist die Anreicherung von mCherry-positiven Zellen spezifisch für die äußere Neuroblastenschicht und wird nicht in Brrn3b-positiven retinalen Ganglienzellen der Ganglienzellschicht beobachtet. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden, sofern keine unerwarteten Komplikationen auftreten.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, korrekte sterile Techniken anzuwenden, eine ruhige Hand bei der Manipulation der Embryonen zu haben und alle notwendigen Materialien bereitzustellen, bevor das trächtige Weibchen anästhesiert wird. Nach diesem Verfahren können elektroporierte Embryonen bis ins Erwachsenenalter überleben, woraufhin weitere Methoden wie Verhaltens- und Funktionsanalysen durchgeführt werden können, um zusätzliche Fragen dazu zu beantworten, wie die Manipulation bestimmter Gene im Embryo die neuronale Funktion im erwachsenen Organismus beeinflusst. Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik Forschern auf dem Gebiet der zentralen Nervensystementwicklung den Weg geebnet, die Genfunktion in vivo bei der Maus zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie fremde DNA in den embryonalen Neuralrohr eingeführt wird. Insbesondere zeigen wir Ihnen, wie man ein trächtiges Weibchen für eine Operation vorbereitet, die Gebärmutter freilegt, DNA injiziert und den Embryo elektroporiert.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Isofluran gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie ein Absaugsystem getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.