Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell
29. September 2011
Hier beschreiben wir eine Reihe von DNA Mutationsassays, dass mit der Hefe chronologische Lebensspanne Modell, um die Gene / Wege, oder regeln dazu beitragen, genomische DNA Instabilität während des Alterns Studie kombiniert werden können.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die altersabhängige genomische Instabilität in Hefe zu untersuchen, indem die chronologische Lebensdauer mit einer Reihe einfacher DNA-Schadens- und Mutationsassays kombiniert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst alle zwei Tage Proben aus Kulturen im chronologischen Alterungsprozess entnommen und auf Lebensfähigkeit mittels Koloniebildende-Einheit- oder CFU-Bildung überprüft werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die DNA-Mutationen zu untersuchen, indem alternde Kulturen beprobt und Zellen auf mutationspezifischem Selektionsmedium ausgestrichen werden.
Schließlich können Ergebnisse erhalten werden, die Veränderungen in DNA-Mutationen während der chronologischen Alterung von Hefe zeigen, indem die Ergebnisse des Mutationsassays auf die Lebensfähigkeit normiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Alterungsforschung zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen, die Alterung und genomische Instabilität in Verbindung bringen. Um die chronologische Lebensdauer (CLS) von Hefe zu bestimmen, impfen Sie zunächst eine einzelne Hefe-Kolonie in ein Milliliter synthetisches komplettes Glucose-Medium (SDC) an und inkubieren sie über Nacht unter Schütteln bei 30 Grad Celsius. Am folgenden Tag verdünnen Sie die Übernachtkultur in 10 Milliliter frisches SDC-Medium auf einen OD600-Wert von 0,05 bis 0,1 und inkubieren sie unter Schütteln bei 30 Grad Celsius über drei Tage.
Am dritten Tag, wenn sich die Zellen in der stationären Phase befinden, verdünnen Sie jede Eloqua 10.000-fach in autoklaviertem Wasser, entnehmen Sie dann zwei Aliquots zu je 10 Mikroliter aus dem Kolben und impfen Sie jeweils 10 Mikroliter der verdünnten Kultur auf eine A-Y-E-P-D-Platte aus. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar werden. Die Anzahl der entstandenen Kolonien oder koloniebildenden Einheiten aus der Kultur des dritten Tages wird als 100 % Überlebensrate betrachtet.
Entnehmen Sie in den folgenden Tagen weiterhin Aliquote aus der alternden Kultur, um sie zu plattieren. Passen Sie die Verdünnungsfaktoren entsprechend an, um sicherzustellen, dass etwa 20 bis 100 Kolonien im CFU-Assay entstehen. Die Probenahme wird eingestellt, wenn die Lebensfähigkeit der Kultur unter 1 % gesunken ist, was typischerweise zwischen den Tagen 11 und 13 der Fall ist. Die Zellviabilität kann auch an Zellen untersucht werden, die auf Platten gealtert wurden.
Um diesen Assay zu beginnen, einen einzelnen Kolonie in ein Milliliter synthetisches komplettes Glucose-Medium impfen und über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Wenn die Kultur auf etwa 108 Zellen pro Milliliter angewachsen ist, die Kultur mit autoklaviertem Wasser auf 100 bis 200 Zellen pro 10 Mikroliter sowie auf 1000 Zellen pro 10 Mikroliter verdünnen. Für jeden Stamm einen Satz von acht bis 20 Tryptophan-ausfallenden SDC-Platten vorbereiten, die entsprechend der Auftragungsdichte beschriftet sind.
Um sicherzustellen, dass 10 bis 100 Kolonien gezählt werden können, unter Berücksichtigung der verringerten Vitalität während des Alterns, plattieren Sie zwei Aliquots von 10 bis 30 Mikrolitern verdünnter Kultur auf jede Platte. Inkubieren Sie den Plattensatz bei 30 Grad Celsius für die Dauer der Lebensdaueranalyse. Am Tag des Plattiervorgangs und anschließend alle zwei Tage entnehmen Sie jeweils eine Platte und geben tropfenweise 0,5 Milliliter Tryptophan hinzu, um das Wachstum lebensfähiger Zellen zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platte anschließend weitere 48 bis 72 Stunden bei 30 Grad Celsius.
Nach 48 bis 72 Stunden. Zählen Sie die Koloniebildenden Einheiten (CFU), um die Vitalität am Tag der Tryptophan-Zugabe zu bestimmen, um DNA-Schäden und Mutationsfrequenz während der chronologischen Alterung zu analysieren. Eine Reihe von Stämmen mit besonderen Merkmalen wird parallel zum Wildtyp-Stamm für den Hefe-CLS-Test kultiviert.
Die Frequenz spontaner Mutationen kann durch die Messung der Häufigkeit der Kanavaninresistenz in einer chronologisch alternden Kultur bestimmt werden. Mutationen im can1-Gen, das für die plasmatische Arginin-Permease kodiert, führen dazu, dass Zellen resistent gegenüber dem Arginin-Analogon L-Kanavanin werden. Kanavanin-resistente Zellen wachsen auf synthetischen kompletten Agarplatten ohne Arginin, die mit L-Kanavaninsulfat ergänzt sind. Die Messung der Trip-positiven Rückmutationsfrequenz in einem Stamm mit einer Amber-Mutation im trp1-Gen ermöglicht die Abschätzung der Rate von Basensubstitutionen während der chronologischen Alterung von Hefe.
Zellen mit positiver Reversion wachsen auf Tryptophan-ausfallenden Platten. Der lysin-negative Stamm EH150 enthält eine +4-Rahmenverschiebung im offenen Leseraster, die zu einem Mangel an Lysin führt und durch kleine Insertionen oder Deletionen rückgängig gemacht werden kann. Die Revertanten werden auf Lysin-ausfallenden Platten selektiert, um grobe chromosomale Umstrukturierungen oder GCR (gcr = gross chromosomal rearrangements) nachzuweisen.
Ein Mutantenstamm wird verwendet, bei dem HX T 13, das sich 7,5 Kilobasen telomerisch zu can eins auf Chromosom fünf befindet, durch eine U-drei-Kassette unterbrochen ist. Mutationen in beiden Genen, can eins und U drei, machen die Zellen resistent gegenüber L-Canavanin bzw. 5-Fluororotinsäure. Da die Häufigkeit von Punktmutationen in beiden Genen gering ist, ermöglicht die Analyse der Resistenzfrequenz gegenüber L-Canavanin und 5-Fluororotinsäure eine Abschätzung der GCR-Rate, um das Ausmaß homologer und nicht-homologer Rekombination zu überwachen. Während des chronologischen Alterns entstehen Mutanten, die entweder 100 % homologe invertierte Wiederholungen oder 91 % homologe Wiederholungen tragen.
Die Rekombination zwischen den IRS an der his-three-Lokusstelle ermöglicht die Expression eines funktionsfähigen His-three-Proteins. Daher wachsen Zellen, in denen eine Rekombination stattgefunden hat, auf Histidin-ausfallenden Platten, die mit Galactose ergänzt wurden. Am dritten Tag, wenn sich die Zellen in der stationären Phase befinden, wird eine geeignete Menge Zellen aus jeder Alterungskultur entnommen.
Da dasselbe Verfahren für alle Assays verwendet wird, wird nur eine Probe verarbeitet. Für dieses Video pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter autoklaviertem Wasser.
Entfernen Sie erneut den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern Wasser. Impfen Sie die Zellen auf die entsprechenden Platten aus, um die gewünschten Revertanten auszuwählen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius. Nach drei bis vier Tagen zählen Sie die Koloniebildenden Einheiten (CFUs). Die Mutationsfrequenz wird auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert. Dieses Diagramm zeigt repräsentative Ergebnisse aus einem typischen chronologischen Lebensdauer-Assay, bei dem das chronologische Überleben von Wildtyp-Zellen mit dem von S. cerevisiae ΔTOR1- und RAS2Δ-Mutanten verglichen wird.
In flüssigen Kulturen weisen Mutanten, die TOR eins, CH neun oder RAs zwei fehlen, eine verlängerte chronologische Lebensspanne auf. Darüber hinaus zeigen Defizite in s CH neun und RAs zwei einen additiven Effekt auf die Förderung der chronologischen Überlebensfähigkeit in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen. Mit dem NC zwei-Vitalitätsassay wird dies im folgenden Diagramm gezeigt.
Am ersten Tag wurden SDC-Wildtyp-Kulturen verdünnt und auf SC-Tripp-Dropout-Platten ohne Kohlenstoffquelle ausplattiert. Die SC-Tripp-Dropout-Platten, die mit Glukose, Ethanol oder Glycerol versetzt wurden, wurden bei 30 Grad Celsius alle zwei Tage inkubiert. Von jedem Satz wurde eine Platte entnommen und die entsprechenden Nährstoffe wurden zugegeben, um Wachstum und Koloniebildung zu ermöglichen.
Die altersabhängige Mutationsfrequenz variiert stark je nach Stamm, Hintergrund, genetischer Modifikation, Kultur, Bedingungen und Alter. Diese Tabelle zeigt typische Ergebnisse, die in einem Wildtyp-Stamm erhalten wurden. Repräsentative Ergebnisse der Trans-Läsions-Synthese sind in diesem nächsten Bild dargestellt.
Die altersabhängige Zunahme der Mutationsfrequenz könnte Veränderungen in der fehlerhaften DNA-Reparatur unter Verwendung von nukleären Extrakten und verschiedenen DNA-Vorlagen beinhalten. Wir können die Translations-Synthese bzw. TLS in zeitlich alternden Zellen bewerten. Nukleäre Extrakte aus drei Tage alten Zellen in stationärer Phase, Wildtyp- und SCH9Δ-Mutanten-Zellen wurden analysiert.
TLS-Produkte mit unbeschädigter Vorlage sind durch durchgezogene Linien gekennzeichnet, TLS-Produkte mit beschädigter Vorlage durch gestrichelte Linien. In nukleären Extrakten aus den langlebigen s CH neun delta-Mutanten wurde keine Trans-Läsions-Synthese beobachtet; freie Primer sind durch den offenen Pfeil gekennzeichnet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die chronologische Lebensdauer und die DNA-Mutationsanalyse bei Hefe durchführt.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, um die altersabhängige genomische Instabilität in Hefe durch die Kombination der Analyse der chronologischen Lebensdauer mit DNA-Mutationsassays zu untersuchen. Der Ansatz ermöglicht es Forschern, die Gene und Signalwege zu erforschen, die an der genomischen DNA-Instabilität während des Alterns beteiligt sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genomik
- Alterung
- Hefebiologie
Hintergrund
- Genomische Instabilität ist ein Kennzeichen des Alterns.
- Hefe dient als Modellorganismus zur Untersuchung von Alterungsprozessen.
- Das Verständnis von DNA-Mutationen kann Einblicke in die Mechanismen des Alterns liefern.
- Frühere Studien haben genomische Instabilität mit verschiedenen alternsbedingten Signalwegen in Verbindung gebracht.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Beziehung zwischen Alterung und genomischer Instabilität in Hefe.
- Entwicklung eines Satzes von DNA-Mutationsassays zu diesem Zweck.
- Normalisierung der Mutationsfrequenzergebnisse auf die Zellviabilität.
Verwendete Methoden
- Alle zwei Tage Kulturen zur chronologischen Alterung entnehmen.
- Lebensfähigkeit mittels Koloniebildende-Einheit (CFU)-Bildung bestimmen.
- Zellen auf mutationspezifischen Selektionsmedien ausplattieren.
- Spontane Mutationsfrequenz und chromosomale Umstrukturierungen messen.
Hauptergebnisse
- Änderungen in DNA-Mutationen wurden während der chronologischen Alterung beobachtet.
- Bestimmte mit der Alterung verbundene Mutationen wurden identifiziert.
- Die Ergebnisse deuteten auf eine Korrelation zwischen genomischer Instabilität und Lebensdauer hin.
- Verschiedene Hefestämme wiesen unterschiedliche Mutationsfrequenzen auf.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelten Assays sind wirksam zur Untersuchung der genomischen Instabilität im Alter.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Mechanismen bei, die Alterung und genomische Instabilität miteinander verbinden.
- Dieser Ansatz kann auf weitere Forschungsvorhaben im Bereich der Alternsforschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht es Biopharma-F&E-Teams, altersbedingte Zielstrukturen mechanistisch entlang der Verbindung zwischen genomischer Instabilität und Langlebigkeitsphänotypen in einem genetisch zugänglichen System zu entschärfen. Sie unterstützt eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielstrukturvalidierung, indem sie altersabhängige DNA-Schadensparameter quantifiziert, die mit karzinogenen Wegen bei Säugetieren korrelieren. Das Modell der chronologischen Lebensspanne von Hefe bietet eine skalierbare und reproduzierbare Plattform für die frühe Entdeckung und Untersuchung von Substanzen oder genetischen Modulatoren, die die Genomintegrität beeinflussen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersuchung therapeutischer Hypothesen, die Alterungspfade mit der Anhäufung von DNA-Mutationen und chromosomaler Instabilität verknüpfen.
- Operationaler Wert: Funktionale Validierung von Zielstrukturen, die an der DNA-Reparatur, Rekombination und Läsionssynthese beteiligt sind, mithilfe genetischer Hefe-Modelle.
- Wissenschaftlicher Wert: Stärkung der Vorhersagekraft durch quantitative Messung von Basenaustauschen, Frameshifts, GCRs und Rekombination als Biomarker für die genomische Integrität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vorbereiten, indem altersgestufte Hefekulturen mit bekannten Mutationsprofilen etabliert werden.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch CFU-normalisierte Mutationsfrequenz-Auswertungen über verschiedene Alterungszeitpunkte hinweg ermöglichen.
- Operationaler Wert: Screening-Bereitschaft und Plattformwiederverwendung durch einfache Selektionsmedien (Canavanin, 5-FOA, Tryptophan, Lysin, Histidin) unterstützen, die mit Hochdurchsatz-Plattierung kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verknüpfen Sie Messgrößen der genomischen Instabilität bei Hefe mit krankheitsrelevanten Systemen, indem Sie konservierte Mechanismen der Translesionssynthese und der homologen Rekombination modellieren.
- Operationaler Wert: Gewährleisten Sie eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Sie Veränderungen der Mutationshäufigkeit verfolgen, die altersbedingten Phänotypen bei Säugetieren entsprechen.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtern Sie risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem Sie genetische Modifikatoren identifizieren, die altersabhängige Mutagenese unterdrücken und die chronologische Lebensdauer verlängern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung der Zielhypothese bis hin zur Identifizierung von Leitsubstanzen, indem sie mechanistische Einblicke in genomische Erhaltungswege liefert, die die zelluläre Lebensdauer beeinflussen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung altersbezogener Gene (z. B. TOR, Sch9, Ras2) hinsichtlich ihrer Modulation der DNA-Schadensakkumulation und Reparaturgenauigkeit.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays und quantitative Ausgaben durch mutationspezifisches Ausplattieren und Normalisierung der Vitalität zur Vergleichbarkeit von Verbindungen oder Stämmen.
- Analytik: Ermöglicht den vergleichenden Nachweis der DNA-Reparaturaktivität mittels translesionssynthetischer Assays auf Basis nukleärer Extrakte und definierter DNA-Vorlagen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem konservierte Mechanismen genomischer Instabilität, wie sie beim Säugetieralterungsprozess und bei Krebs beobachtet werden, modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität für die Langzeituntersuchung genetischer oder pharmakologischer Interventionen zur Genomstabilität entlang der gesamten Alterungsskala.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuversicht bei der Zielvalidierung durch mechanistische Absicherung von Genominstabilitätsfaktoren, die zu Alterungsphänotypen beitragen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Mutationsfrequenzmessungen, normiert auf lebensfähige Zellzahlen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch die Verknüpfung der Zielmodulation mit reduzierter Mutagenese und verlängerter Lebensdauer in einem evolutionär konservierten Modellsystem.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung altersbezogener Zielstrukturen basierend auf deren Einfluss auf DNA-Reparaturwege und genomische Integrität.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Hefe-Genetik, der Aufrechterhaltung der chronologischen Lebensdauer sowie in der Konzeption von Mutationsassays voraus.
- Benötigt eine Inkubationsinfrastruktur für schüttelnde Kulturen bei 30 °C und plattenbasierte Selektionsassays.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung zwischen den Teams hinsichtlich Verdünnungsfaktoren, Ansätdichten und Protokollen zur Normierung der Vitalität.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung hefe-spezifischer Endpunkte (z. B. Canavanin-Resistenz) auf surrogatmäßige Endpunkte in Säugetiermodellen.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die lange Dauer des Assays (11–13 Tage) sowie die Abhängigkeit von genetischen Markern für bestimmte Mutationsarten.
