Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Biomoleküle wie DNA und Proteine in wässrigen Puffern in Echtzeit mittels Rasterkraftmikroskopie abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die zu bildgebenden Biomoleküle vorbereitet werden. Anschließend wird das Rasterkraftmikroskop eingerichtet und eine FM-Kantilever-Sonde positioniert.

Die Probenoberfläche und die interessierenden Biomoleküle werden anschließend abgebildet und analysiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die unter Pufferbedingungen mittels Rasterkraftmikroskopie die allgemeine Größe, Menge und Organisation von DNA und Proteinen sowie heterogener biomolekularer Komplexe zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der molekularen Chaperone zu beantworten, beispielsweise welche STO-Geometrie Chaperone und Co-Chaperone im Komplex mit einem Zielprotein aufweisen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist vorteilhaft, da die Vorbereitungsschritte für die A FM- und Kent-Hebelsonde aufgrund der Komplexität der damit verbundenen manuellen Handgriffe schwer allein anhand schriftlicher Anleitungen zu erlernen sind. Die Durchführung der Methode demonstrieren Morgan Shannon und John Gertz, zwei Studenten aus meinem Labor. Zunächst werden die zu bildgebenden Proteine oder DNA-Moleküle isoliert und in einem wässrigen Puffer suspendiert. Nach Bestätigung der Reinheit der Probe wird diese zur Förderung der Anheftung der Probe an Glimmer auf Eis in einem FM-Absorptionspuffer inkubiert.

Für Proteinstichproben verwenden Sie einen 10 Millimolar HEPES-Puffer. Für DNA eignet sich ein magnesiumhaltiger Puffer, der aus 10 Millimolar Tris, pH 7,5, 10 Millimolar Natriumchlorid und 2 Millimolar Magnesiumchlorid besteht, um die AFM-Sonde zu montieren. Setzen Sie den Flüssigzellen-Sondenhalter auf die entsprechende Cantilever-Montage-Dockstation.

Suchen Sie den langen, dicken Kragarm der scharfen Nitridhebelsonde, die für die Abbildung verwendet werden soll. Übertragen Sie sie vorsichtig in den Sondenhalter für die Flüssigzelle, wobei sichergestellt werden muss, dass die Spitze nach oben bleibt. Untersuchen Sie anschließend den Kragarm unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass er unbeschädigt ist und korrekt im Sondenhalter für die Flüssigzelle sitzt.

Entfernen Sie dann vorsichtig einen AFM-Kopf aus der Keilführung der Instrumentenanordnung, indem Sie die Halteschraube für den Kopf festziehen. Drehen Sie den AFM-Kopf um und drücken Sie den Probenträger für die Flüssigzelle fest auf die vier Stifte an der Unterseite des AFM-Kopfs. Setzen Sie den AFM-Kopf schließlich vorsichtig wieder in die Keilführung des Instruments ein.

Um den aFM weiter für die Bildgebung von Proben vorzubereiten, bewegen Sie die Knöpfe des integrierten Lichtmikroskops, um die Cantileverspitze zu lokalisieren, und justieren Sie mithilfe der Pfeiltasten „Hoch“ und „Runter“ des Optik-Controllers in der Software die Fokusebene der Cantileverspitze. Nutzen Sie die Justierknöpfe für den Laser, um den Laserstrahl auf die Cantileverspitze auszurichten. Dieser Schritt gehört zu den technisch anspruchsvollsten des Protokolls. Die Positionierung erfolgt manuell und erfordert eine präzise Einstellung der Knöpfe.

Sorgfältige Überwachung des Lasers im Reflexionspunkt und im Beleuchtungspunkt erhöht die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Ausrichtung. Anschließend justieren Sie die Regler des Photodetektors am FM-Kopf, um den Photodetektor zu zentrieren. Platzieren Sie ein frisch gespaltene Blatt Glimmer, das an einer metallischen FM-Probenplatte befestigt ist, auf dem magnetisierten Probenhalter oben auf der FM-Halterplatte.

Drehen Sie die FM-Halterplatte, sodass die Probenscheibe für die anfängliche Bildaufnahme positioniert ist. Verwenden Sie die Fokussierflächensteuerung der Gerätesoftware, um den FM-Kopf in Richtung der Oberfläche der MICA-Probenscheibe abzusenken. Wählen Sie das Abstimm-Symbol in der Gerätesoftware und stimmen Sie den Cantilever ab, bis deutliche Merkmale auf der MICA-Oberfläche oder die Spiegelung der Spitze scharfgestellt sind.

Die Resonanzfrequenz empfohlener MSNL- oder SNL-Sonden liegt zwischen 20 und 60 Kilohertz. Wählen Sie einen 5-%-Spitzen-Offset, um die MICA-Probe abzubilden. Bringen Sie zunächst die Sonde auf der MICA-Oberfläche in Kontakt, stellen Sie die anfängliche Scan-Größe auf 10 Mikrometer und die Scan-Frequenz auf ein Hertz ein.

Erfassen Sie vollständige Scan-Bilder des 10-Mikrometer-Feldes. Verringern Sie anschließend die Scan-Größe auf fünf, einen und 0,5 Mikrometer und erfassen Sie jeweils vollständige Bilder jedes Feldes. Lösen Sie die Sonde, indem Sie im Instrumenten-Software auf das Löse-Symbol klicken.

Um Biomoleküle von Interesse abzubilden, mischen Sie fünf µL der vorbereiteten Probe mit 45 µL frischem Absorptionspuffer. Geben Sie vorsichtig 50 µL der Lösung mit einer Konzentration von 0,5 µg/mL enthaltenden Biomolekülen direkt auf die MICUs-Oberfläche. Warten Sie fünf Minuten, damit die Biomoleküle in der Probe an der Micah-Oberfläche haften können.

Danach pipettieren Sie weitere 50 bis 100 Mikroliter Pufferlösung in den Flüssigkeitszellen-Probenhalter. Achten Sie darauf, die Sonde, einen FM-Kopf oder MICA nicht mit der Pipettenspitze zu berühren, stellen Sie den Fotodetektor neu ein und richten Sie den Laser bei Bedarf erneut auf dem Cantilever aus. Anschließend verwenden Sie die Gerätesoftware, um die Sonde erneut einzurichten.

Vergrößern Sie die Scan-Größe, um interessierende Bereiche zu identifizieren. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, wählen Sie mehrmals das Symbol zum Zurückziehen in der Gerätesoftware aus, um die Sonde zu lösen. Spülen Sie anschließend den Probenträger für die Flüssigzelle und die Probenscheibe gründlich mit destilliertem Wasser.

Danach mit Druckluft probieren. Ein Beispiel eines A-FM-Bildes ist hier dargestellt. Das Glimmer-Substrat bietet eine molekular ebene Oberfläche, an die sich DNA und Protein anlagern können.

Die Bildgebung von MICA vor biologischen Molekülproben liefert eine negative Kontrolle und eine Beurteilung der Bildrauschen. Außerdem gewährleistet sie, dass der Cantilever korrekt abgestimmt ist, und gibt Sicherheit, dass die anschließende Bildgebung der Probe erfolgreich verlaufen wird. Doppelsträngige, vermutlich supercoiled vorliegende Plasmadna wird leicht an ihrem asymmetrischen Erscheinungsbild und ihrer gleichmäßigen Ablagerung auf dem zuvor unauffälligen MICA-Substrat erkannt.

Protein-Komplexe mit diskreten Partikelgrößen sind außerdem eindeutig vom Micah-Substrat unterscheidbar. Unterschiede in der Partikelgröße weisen auf Heterogenität der Probe hin und können nützlich sein, um die Stöchiometrie, Geometrie oder biochemische Aktivität der Protein-Komplexe abzuschätzen. Die allgemeine diagonale Form und die konsistente Ausrichtung der beobachteten Proteinpartikel.

Hier ist ein Bildartefakt zu sehen, da die Proteine auf dem Micah-Substrat erwartungsgemäß zufällig ausgerichtet wären. Mögliche Ursachen des beobachteten Artefakts sind eine physische Spitzenanomalie oder eine FM-Aufnahme mit zu hoher Scan-Geschwindigkeit, wobei die Tip-Konvolution präzise Längenmessungen entlang der X- und Y-Achse oder der Höhe entlang der Z-Achse verhindert. Dennoch können relative X- und Y-Messungen nützlich sein, um biophysikalische Eigenschaften der abgebildeten Biomoleküle abzuschätzen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Cantilever genau einzustellen und den Photodetektor auszurichten, indem man diesem grundlegenden FM-Verfahren folgt.

Weitere Schritte, wie die Verwendung einer Pufferaustausch-Flüssigzelle, können hinzugefügt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu untersuchen, beispielsweise die Fähigkeit molekularer Chaperone, die Freisetzung von Steroidrezeptoren von ihren DNA-Bindungsstellen zu beeinflussen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man DNA-Proteine und biomolekulare Komplexe mittels Rasterkraftmikroskopie unter Pufferbedingungen abbilden kann.