Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, die mechanischen Eigenschaften der Schnittstelle zwischen Zellkern und dessen physikalischer Verbindung mit dem umgebenden Cytoskelett zu messen. Dies wird erreicht, indem mechanische Dehnung auf Zellen ausgeübt wird, die auf einer transparenten Silikonmembran kultiviert sind, und die induzierten Verformungen des Zellkerns abgebildet werden. Größere Kerndeformationen entsprechen einer verringerten Steifigkeit des Kerns, da auch Veränderungen in der Kopplung zwischen Nukleus und Cytoskelett die induzierten Kerndeformationen beeinflussen können.

Die intrazelluläre Kraftübertragung zwischen Cytoskelett und Zellkern wird direkt untersucht, indem lokalisierte Dehnung auf das Cytoskelett ausgeübt wird. Anschließend werden die Verschiebungen fluoreszenzmarkierter nukleärer NU- und cytoskelettaler Strukturen abgebildet. Die Ergebnisse zeigen die Steifigkeit der Zellkerne im Verhältnis zum umgebenden Cytoskelett.

Aufgrund der Substrat-Dehnungsversuche zeigt der Mikronadel-Manipulationsassay, dass die Störung der Kopplung zwischen Nukleus und Zytoskelett zu Defekten bei der intrazellulären Kraftübertragung führt. Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber etablierten Methoden wie der Mikropipettenaspiration isolierter Zellkerne besteht darin, dass sie die Untersuchung der nukleären Mechanik in intakten lebenden Zellen ermöglichen, ohne die normale zelluläre Architektur zu stören. Diese Methoden können Aufschluss darüber geben, wie Veränderungen in der Zusammensetzung der nuklearen Hülle die mechanischen Eigenschaften des Zellkerns beeinflussen können.

Sie können auch verwendet werden, um die Rolle der nukleären Mechanik im Zusammenhang mit Erkrankungen wie LA-Neuropathien oder Krebs zu untersuchen. Jede Dehnungsschale besteht aus einer speziell angefertigten bodenlosen Kunststoffschale mit einem Durchmesser von drei Zoll und einem Kunststoff-O-Ring, der eine Silikonmembran hält, die als Substrat für die Zellkultur dient. Zur Vorbereitung der Dehnungsschale wird ein vier Zoll mal vier Zoll großes Stück Silikonmembran zwischen einen O-Ring und die Schale eingespannt, überschüssige Membran vorsichtig ausgeschnitten, die Dehnungsschale mit entionisiertem Wasser gespült und anschließend die Schale vor der Beschichtung der Silikonmembran mit extrazellulären Matrixmolekülen autoklaviert. Anschließend wird ein Referenzpunkt außen auf der Membran in der Mitte des Bodens markiert.

Dieser Markierungspunkt hilft dabei, dieselben Zellen während der Dehnungsversuche zur einachsigen Dehnungsanwendung zu identifizieren. Zwei parallele Streifen Klebeband werden um den Referenzpunkt angebracht, um die Bildung der Membran in einer Dimension einzuschränken. Um eine optimale Zelladhäsion zu gewährleisten, beschichten Sie die Silikonmembranen mit drei Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin oder einem anderen geeigneten extrazellulären Matrixprotein.

Bedecken Sie die Ansatzschale mit einer umgedrehten 10 cm großen Polystyrolschale und inkubieren Sie sie am folgenden Tag über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Membran einmal mit PBS, um überschüssiges Protein zu entfernen. Füllen Sie die Schale mit 10 Milliliter Wachstumsmedium und stellen Sie sie beiseite.

Nachdem die beschichtete Silikonmembranschale vorbereitet wurde, lösen Sie die Zellen mit 0,05 % Trypsin ab und säen Sie adhärente Zellen in die Schale ein, und zwar in Wachstumsmedium. Dieses Verfahren wird mit embryonalen Mauszellen demonstriert.

Fibroblasten oder Mes inkubieren die Zellen 24 bis 48 Stunden unter normalen Kulturbedingungen. Ein umgekehrtes Mikroskop, das für Substrat-Dehnungsexperimente ausgestattet ist, umfasst eine Dehnungsvorrichtung, die aus einer Grundplatte besteht, die auf die Mikroskopbühne passt. Die Platte enthält einen zentralen zylindrischen Platin, der dazu dient, Dehnung auf den zentralen Bereich der Silikonmembran auszuüben.

Das Gerät verfügt außerdem über eine bewegliche Platte, die die Dehnungsschale hält und entlang von vier Führungsstiften nach oben und unten gleiten kann, sowie über ein fünf Pfund schweres Gewicht, um eine Last aufzubringen. Um die Kerne sichtbar zu machen, inkubieren Sie die Zellen in der Dehnungsschale mit einem Mikrogramm pro Milliliter Hoeschst-Färbung für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation saugen Sie das Medium ab und ersetzen es durch 15 Milliliter phenolrotfreies Wachstumsmedium mit 25 Millimolar HEPES.

Danach die Scheibe in den Scheibenträger einschrauben und vorsichtig Schmiermittel auf den Rand der Unterseite der Silikonmembran auftragen, um ein Gleiten der Membran entlang des zentralen Platin zu gewährleisten. Darauf achten, dass der zentrale Bereich der Membran frei bleibt. Die Basisplatte auf die Mikroskopstufenplatte setzen und den Scheibenträger vorsichtig auf die Basisplatte montieren.

Stellen Sie sicher, dass in der anfänglichen Ruheposition die Silikonmembran der Dehnungsplatte locker auf dem zentralen Platin aufliegt. Fokussieren Sie anschließend auf die Unterseite der Silikonmembran und suchen Sie den zentralen schwarzen Referenzpunkt. Dieser Punkt dient als Ausgangspunkt für alle Bildaufnahmen und hilft dabei, dieselben Zellen während und nach der Dehnung wiederzufinden.

In diesem Bild füllt der zentrale Punkt das gesamte Sichtfeld aus. Gehen Sie vom Rand des Punktes aus und stellen Sie den Fokus so ein, dass die Zellen und die Oberseite der Silikonmembran sichtbar werden. Suchen Sie gut ausgebreitete Zellen mit zentral gelegenen Kernen.

Erwerben Sie ein Kontrastbild des Schnitts, das auf die Zellkontur und die Silikonmembran fokussiert sein sollte. Erwerben Sie anschließend ein Fluoreszenzbild der nuklearen Haken-Färbung, das auf die zentrale Ebene des Zellkerns fokussiert sein sollte. Nach der Aufnahme von Bildern von fünf bis 15 Zellen bewegen Sie sich zurück zum zentralen Punkt.

Wenden Sie das Gewicht langsam auf die Dehnungsschale an, um eine gleichmäßige Dehnungsanwendung zu erzielen, und zwar in der Mitte der Schale. Die maximale aufgebrachte Substratdehnung wird durch Nylonabstandshalter begrenzt, die nach der Dehnungsanwendung auf den vertikalen Ausrichtungsstiften platziert werden. Fokussieren Sie auf den Boden der Silikonmembran und lokalisieren Sie erneut den Referenzpunkt, ausgehend von diesem Punkt.

Verschieben Sie dieselben Zellen erneut und nehmen Sie erneut ein Phasenkontrastbild sowie das Ende des Fluoreszenzbildes jeder Zelle im Kern unter voller Belastung auf, wobei versucht werden sollte, die Fokusebenen der ursprünglichen Bilder möglichst genau zu reproduzieren. Dieser Vorgang sollte 10 Minuten nicht überschreiten, um eine aktive Umgestaltung und Anpassung der Zelle an das fremde Substrat zu vermeiden. Nachdem alle entsprechenden Bilder aufgenommen wurden, bewegen Sie den Mikroskoptisch zurück zum Ausgangspunkt.

Entfernen Sie das Gewicht vorsichtig von der Schalenhalterplatte und lassen Sie die Silikonmembran gegebenenfalls entspannen. Drücken Sie die Dehnungsschale sanft nach oben, bis sie sich in der Ausgangsposition befindet. Anschließend nehmen Sie Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder auf.

Bilder der Zellen nach der Belastung werden genau wie bei den Belastungsbildern beschrieben ausgewertet; Bilder von Zellen und fluoreszenzmarkierten Kernen vor, während und nach der Belastungsanwendung werden analysiert, um die normalisierte Kerndehnung zu berechnen. In dieser Demonstration wird ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript für die Analyse verwendet, es sind jedoch mehrere alternative Optionen verfügbar, um die aufgebrachte Substratdehnung manuell zu berechnen, indem die Positionen von drei bis sechs Kontrollpunkten auf der Membran zwischen den entsprechenden Vorher- und Nachher-Belastungsbildern übereinstimmend zugeordnet werden. Das MATLAB-Programm berechnet anschließend die aufgebrachte Membrandehnung, indem es die Positionen übereinstimmender Kontrollpunkte zwischen den Vorher- und Vollbelastungsbildern vergleicht.

Die Positionen werden außerdem hinsichtlich der Restdehnung zwischen den Bildern vor und nach der Dehnung verglichen. Die Kontrollpunkte werden gleichzeitig zur Registrierung der Bildpaare verwendet, was dabei hilft, beschädigte oder sich ablösende Zellen zu erkennen. Anschließend wählen Sie mithilfe eines separaten MATLAB-Programms manuell die Zellkerne aus, das die Kerndeformation für jeden einzelnen Kern berechnet.

Dies wird erreicht, indem die Kerngröße zwischen entsprechenden Fluoreszenzbildern vor und nach der Belastung angeglichen wird oder indem intranukleäre Marker abgeglichen werden, um geringfügige Unterschiede in der aufgebrachten Membranbelastung zwischen verschiedenen Experimenten zu berücksichtigen. Die Ergebnisse werden als normierte nukleäre Dehnung angegeben. Diese ist definiert als das Verhältnis der induzierten nukleären Dehnung zur aufgebrachten Membrandeformation, berechnet für jeden Kern.

Die MATLAB-Skripte sind auf Anfrage im Lambing-Labor erhältlich. Als letzter Schritt wird jeder Kern validiert, und Messungen von Zellen, die sich während der Dehnungsanwendung ablösen oder beschädigt werden, werden ausgeschlossen. MEFs, die sich über zwei unterschiedliche Bereiche auf der Silikonmembran ausgebreitet hatten, wurden vor, während und nach der Anwendung einer 20 %igen einachsigen Dehnung mit Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Hier gezeigt ist ein Beispiel für ein erfolgreiches Experiment mit validen Kernen aus Zellen, die die Dehnungsanwendung ohne Schäden oder Ablösung überlebt haben.

Im Gegensatz dazu zogen sich die hier gezeigten Zellen während der Belastungsanwendung ein oder lösten sich teilweise ab und wurden daher von der Analyse ausgeschlossen. Die Zelle auf der linken Seite zeigt Anzeichen für Zytoskelettschäden und Kernkollaps, während die Zelle auf der rechten Seite sich während der Belastungsanwendung teilweise ablöst und einzieht. Dies kann ein Hinweis auf übermäßige Belastung sein.

Hier wird eine Analyse der normalisierten nukleären Dehnung in einer Reihe verschiedener Meth-Zelllinien von Mäusen mit Lamin-A/C-Mangel gezeigt, wobei die Zellen entweder ein leeres Vektorplasmid oder das Wildtyp-Lamin A ektopisch exprimieren, verglichen mit Zellen aus Wildtyp-Wurfgenossen. Der Verlust der Expression der nukleären Hüllproteine Lamin A/C führt zu einer erhöhten normalisierten nukleären Dehnung. Dies deutet auf eine verminderte nukleare Steifigkeit hin, die durch die erneute Einführung von Wildtyp-Lamin A teilweise oder vollständig wiederhergestellt werden kann. Zur Vorbereitung des Mikronadelmanipulations-Experiments inkubieren Sie eine 35-Millimeter-Zellkulturschale mit Glasboden bei einer niedrigen Konzentration an Fibronectin zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation waschen Sie die Schale zweimal mit HBSS und geben zwei Milliliter Wachstumsmedium in die Schale.

Dann werden murine embryonale Fibroblasten mit 0,05 % Trypsin abgelöst und in zwei Milliliter Wachstumsmedium auf eine mit Fibronectin beschichtete Glasbodenkulturbox ausgesät. Um einzelne, adhärente, nicht konfluente Zellen zu erhalten, werden die Zellen über Nacht in den Inkubator zurückgestellt. Um die Zellen zu färben, werden MIT-Tracker-Mitochondrienfarbstoff und Hoechst-Kernfarbstoff dem Wachstumsmedium zugesetzt. Dieses Wachstumsmedium wird den Zellen hinzugefügt und anschließend inkubiert.

Als Nächstes waschen Sie die Zellen, indem Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in Hank’s gepuffertem Salzlösungsinzubereiten. Anschließend geben Sie ein phenolrotfreies Wachstumsmedium mit 25 Millimolar HEPES zu den Zellen, um sie abzubilden.

Bei dem Mikronadel-Experiment eine zuvor gezogene Mikronadel in einen Mikromanipulator einführen, der an ein invertiertes Mikroskop mit einer digitalen Kamera mit Ladungskopplungseinrichtung gekoppelt ist. Kamera und Mikronadel in der Nähe einer einzelnen Zelle fokussieren. Ein Bild der einzelnen Zelle aufnehmen, ohne dass die Mikronadel in das Cytoskelett eingeführt wurde.

Bei der Phasenkontrastmikroskopie eine fluoreszierende Aufnahme der Haken 3 3, 3 4 2 Färbung und eine fluoreszierende Aufnahme der mitochondriellen Färbung mit einem 60x-Objektiv an einem inversen Mikroskop aufnehmen. Mithilfe des Mikromanipulators vorsichtig die Mikronadel in das Cytoplasma einer Zelle in einem festgelegten Abstand zur nuklearen Peripherie einführen und eine Phasenkontrastaufnahme sowie eine fluoreszierende Aufnahme der Haken 3 3, 3 4, 2 Färbung und eine fluoreszierende Aufnahme der mitochondriellen Färbung aufnehmen. Die Mikronadel mit einer Geschwindigkeit von einem Mikrometer pro Sekunde mithilfe des computergesteuerten Mikromanipulators um eine bestimmte Distanz in Richtung Zellperipherie bewegen, während automatisch alle 10 Sekunden Bilder aufgezeichnet werden.

Während sich die Mikronadel auf einen bestimmten Abstand in Richtung Zellperipherie bewegt, sollte der Mikromanipulator über einen Computer gesteuert werden, um eine konsistente Mikromanipulation zu gewährleisten. Nach Abschluss der Prozedur werden Bilder aufgenommen, und die vor, während und nach der Mikronadel-Manipulation gewonnenen Fluoreszenz-bildgebenden Aufnahmen der markierten Strukturen des Zellkerns und des Cytoskeletts werden analysiert, um die Verschiebung kleiner intrazellulärer Bereiche zu berechnen. In dieser Demonstration wird ein eigens verfasstes MATLAB-Skript für die Analyse verwendet, jedoch stehen auch mehrere andere Optionen zur Verfügung.

Das MATLAB-Skript ist auf Anfrage im Lambing-Labor erhältlich, um die durch die Mikronadel erzeugte Verschiebung zu messen. Das MATLAB-Programm verwendet einen normalisierten Kreuzkorrelationsalgorithmus, um die Verschiebung zwischen der ursprünglichen Position der fluoreszenzmarkierten Merkmale und ihrer neu bestimmten Lage zu berechnen. Die Verschiebungen werden anschließend als Vektorfelder dargestellt und als numerische Werte gespeichert.

Der nächste Schritt besteht darin, die resultierenden Verschiebungsvektor-Karten zu verwenden, um mit Matlab die mittleren Verschiebungen innerhalb des Cytoskeletts oder des Zellkerns zu bestimmen. Wählen Sie zunächst drei oder mehr Punkte innerhalb des Cytoskeletts an der Stelle der Dehnungsanwendung aus. Nehmen Sie in der Verschiebungsvektor-Karte den durchschnittlichen Zahlenwert, um die Menge der cytoskelettalen Dehnung in der Nähe der Anwendungsstelle zu ermitteln, die während der Mikronadelanwendung erzeugt wurde.

Wählen Sie anschließend drei oder mehr Punkte innerhalb des Zellkerns in der Nähe der Stelle der Kraftanwendung aus und bilden Sie den Mittelwert. Dieser Wert repräsentiert das Ausmaß der Kerndehnung in der Nähe der Stelle, an der die Mikronadel angewendet wurde. Bestimmen Sie mit derselben Methode die Kern- und Zytoskelettdehnung abseits der Kraftanwendungsstelle anhand von Punkten, die in diesen jeweiligen Bereichen ausgewählt wurden.

Ein Mikronadel-Manipulationsassay wurde durchgeführt, um die intrazelluläre Kraftübertragung zu messen. Gezeigt sind Phasenkontrastbilder und Fluoreszenzbilder eines Fibroblasten, der mit einer blauen Kernfärbung und der grünen MIT-Tracker-Färbung für Mitochondrien markiert ist. Eine Mikronadel wurde in das Cytoskelett in einem definierten Abstand zum Kern eingeführt und anschließend in Richtung der Zellperipherie bewegt.

Die mitochondriale Verschiebung verlängert sich vor, während und nach mechanischer Belastung des Zytoskeletts, und anschließend wurden die Verschiebungen als Vektoren dargestellt. Jeder Vektor stellt die Verschiebung dar, die als Abweichung zwischen der ursprünglichen Position und der neu bestimmten Lage berechnet wurde. Bereiche mit geringer Bildintensität oder unzureichender Textur wurden von der Analyse ausgeschlossen.

Die zytoskelettale und kernbezogene Verschiebung wurde anschließend in ausgewählten Bereichen in zunehmenden Abständen von der Dehnungsanwendungsstelle für sowohl Kontrollfibroblasten als auch Fibroblasten quantifiziert. Bei intakter Nukleo-Zytoskelett-Kopplung werden Kräfte über die gesamte Zelle übertragen, was zu einer induzierten Verformung von Zellkern und Zytoskelett führt, die sich mit zunehmender Entfernung von der Dehnungsanwendungsstelle langsam abschwächt. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen mit gestörter Nukleo-Zytoskelett-Kopplung eine lokal begrenzte Verschiebung in der Nähe der Anwendungsstelle und nur geringe induzierte Verformungen in größerer Entfernung.

Eine vergleichbare zytoskelettale Dehnungsanwendung an der Stelle der Mikronadelinsertion wird sowohl bei Kontrollfibroblasten als auch bei Fibroblasten mit gestörter Nukleo-Zytoskelett-Kopplung beobachtet. Die induzierte nukleäre und zytoskelettale Verschiebung in anderen Regionen war jedoch bei Fibroblasten mit gestörter Nukleo-Zytoskelett-Kopplung signifikant geringer als in Kontrollzellen. Eine Abnahme der zytoskelettalen und nukleären Verschiebung weg von der Dehnungsanwendungsstelle weist daher darauf hin, dass die Kraftübertragung zwischen Zytoskelett und Kern gestört war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Mechanik des Zellkerns und die Übertragung intrazellulärer Kräfte zwischen Kern und Zytoskelett messen kann. Sie können diese Techniken verwenden, um die Auswirkungen von Mutationen in Kernhüllenproteinen oder Veränderungen in der Zusammensetzung der Kernhülle zu untersuchen, die während der Entwicklung oder bei Krebserkrankungen auftreten.