Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

Es stehen relativ wenige Arzneimittel zur Behandlung von Mycobacterium tuberculosis zur Verfügung, weshalb Resistenz gegen jedes Medikament besorgniserregend ist. Dieser Videoartikel beschreibt ein Verfahren zum gleichzeitigen Testen der Antibiotikaresistenz von M. tuberculosis gegenüber 12 verschiedenen antimikrobiellen Wirkstoffen. Daher ist die Fähigkeit, die antimikrobielle Resistenz von M. tuberculosis schnell nachzuweisen, von großer Bedeutung, um die Ausbreitung resistenter Stämme einzudämmen. Hierzu dient der Test der Antibiotikasuszeptibilität.

M. tuberculosis wird zunächst auf festem Medium oder in Brühe kultiviert, um eine bakterielle Suspension herzustellen. Der Inokulum wird präpariert und in eine Mikrotiterplatte gegeben, die unterschiedliche Konzentrationen von 12 Arzneimitteln enthält, darunter First-Line- und Second-Line-Medikamente. Nach der Inkubation wird das Ausmaß des Wachstums in jedem Brunnen entweder manuell mit einer Spiegelbox oder mithilfe eines halbautomatischen Plattenlesegeräts bestimmt.

Die erhaltenen Daten zeigen die minimale Hemmkonzentration für jedes getestete Medikament und geben an, gegenüber welchen Antibiotika der untersuchte TB-Stamm resistent ist. Diese Ergebnisse unterstützen bei der Auswahl des geeigneten Medikaments zur Behandlung von TB. Hallo, mein Name ist Nancy Ek und ich bin Leiterin des Labors für Mykobakteriologie an der Mayo Clinic in Rochester, Minnesota.

Heute werden wir eine Methode zur Durchführung von Antibiotikasuszeptibilitätstests für Mycobacterium tuberculosis beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Makro-Brühenverdünnung besteht darin, dass für jedes Medikament eine MHK bestimmt wird und 12 Antibiotika gleichzeitig getestet werden. Kurt Jude, ein Qualitätsbeauftragter in meinem Labor, wird das Verfahren am Laborarbeitsplatz demonstrieren.

Bereiten Sie dieses Verfahren vor, indem Sie eine Blutagarplatte, drei Middlebrook-7H10-Platten, ein Saline-Tween-Glaskügelchenröhrchen und eine Mikrotiterplatte mit dem Namen des Patienten und der Probenidentifikationsnummer beschriften. Zusätzlich kennzeichnen Sie die Blutagar- und die 7H10-Platten als Reinheit. Kennzeichnen Sie eine dieser 7H10-Platten als 1:1-Kolonienzählung und die andere als 1:50-Kolonienzählung.

Stellen Sie dann das Tablett in den Durchreichebehälter. Bereiten Sie anschließend die Arbeit in der Biosicherheitsstufe drei (BSL-3) einrichtung vor, indem Sie eine geschlossene Vorderseite-Schutzkluft, Kopfbedeckung, Handschuhe, Schuhüberzieher und einen Atemschutz tragen. Hier wird ein PAPR-Atemschutz verwendet.

Nehmen Sie dann das Fach aus der Übergabekammer heraus. Desinfizieren Sie anschließend im BSL-3-Labor die Oberfläche des biologischen Sicherheitswerks. Anschließend platzieren Sie ein mit Desinfektionsmittel getränktes Papierhandtuch etwa 15 cm von der Luftaustrittsplatte entfernt innerhalb des Sicherheitswerks neben dem Papierhandtuch.

Stellen Sie Inokulationshölzer, Pipetten und Spitzen, einen geeigneten Abfallbehälter, einen Nephi, TER und einen Vortex bereit. Sobald der Haube vorbereitet ist, stellen Sie den Organismus zusammen mit einem Rack, das einen McFarland 0,5-Standard A seven H nine Brühe mit OADC, sowie einen Salinperlenrohr auf das Papiertuch. Dieser Aufbau erfolgt aus festem Medium.

Bereiten Sie das Inokulum aus einer Kultur auf festem Medium aus einer Patientenprobe vor. Verwenden Sie eine sterile Öse, um die Kolonien abzukratzen und in das Salin-Tween-Glasperlkügelchenröhrchen zu überführen. Vortexen Sie die Suspension 30 bis 60 Sekunden lang.

Visuell die Probe überprüfen und mit dem McFarland-Standard vergleichen. Die übertragene Menge sollte gleich oder größer als der Standard sein. Falls nicht, weitere Bakterienprobe hinzufügen und erneut vortexen.

Wenn der McFarland-Standard erreicht ist, lässt man den Inokulum 15 Minuten lang ruhen, damit sich größere Bakterienklumpen absetzen können. Danach verwendet man ein Nefi TER, um die Dichte der suspendierten Bakterien auf Null zu messen. Das Nephi TER.

Platzieren Sie zunächst ein leeres Salinperlen-Tween-Röhrchen im Nephi ter. Drücken Sie die Kalibrierungstaste, um das Gerät zu nullen, und stellen Sie dann den McFarland-0,5-Standard in den Nephi ter. Drücken Sie erneut die Kalibrierungstaste. Sobald das Gerät kalibriert ist, entfernen Sie den McFarland-Standard und fügen die Inokulationsflüssigkeit ein.

Die Inokulumablesung sollte der Ablesung des McFarland-Standards entsprechen. Falls die Ablesung zu niedrig ist, entfernen Sie das Reagenzglas und übertragen mehr Bakterien von der Platte. Anschließend vortexen und die Probe erneut ablesen.

Wenn der Wert zu hoch ist, geben Sie Salin-Tween in das Röhrchen und wirbeln Sie es. Lesen Sie die Probe anschließend erneut ab. Passen Sie den Inokulum nach Bedarf weiter an, bis die Konzentration der Bakterien dem McFarland-Standard entspricht.

Als Nächstes verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette und eine lange aerosolresistente Pipettenspitze, um 100 Mikroliter Inokulum aus dem oberen Drittel des Röhrchens zu entnehmen. Um Klumpen, die sich am Boden absetzen, zu vermeiden, vorsichtig die mit dem Inokulum versetzte Middlebrook-7H9-Brühe langsam 20 Sekunden lang verwirbeln, um das Inokulum zu plattieren. Beginnen Sie damit, die Mikrotiterplatte aus der Verpackung des Herstellers zu entnehmen. Wenn das Trockenmittel blau ist oder die Folienverpackung beschädigt ist, verwenden Sie diese nicht.

Die Platte enthält bereits die 12 zu testenden antimikrobiellen Substanzen in jedem Brunnen, einschließlich der wirksamsten oder ersten Wahl-Medikamente sowie Medikamente der zweiten Wahl. Gießen Sie vorsichtig das sieben H neun Brühe-Inokulum in ein Trth, wobei darauf geachtet werden muss, keine Aerosole zu erzeugen. Danach platzieren Sie die Mikrotiterplatte mit dem Etikett nach außen, wie hier gezeigt, und verwenden einen 12-Kanal-Pipettierer, um 100 Mikroliter des Inokulums in jeden Brunnen zuzugeben.

Bereiten Sie anschließend Platten zur Durchführung von Koloniezählungen vor. Erstellen Sie zunächst eine undiluierte Platte, indem Sie eine Ein-Mikroliter-Schleife der Probe aus dem positiven Kontrollbrunnen auf die mit 1:1 beschriftete H 10-Platte übertragen. Verwenden Sie dann die Schleife, um die Platte wie hier gezeigt zu bestreichen.

Danach übertragen Sie mit einer Ein-Mikroliter-Schleife eine Probe aus dem Positivkontrollbrunnen und wirbeln sie in das Reagenzglas mit 50 Mikrolitern Wasser an. Tragen Sie ein Mikroliter dieser Verdünnung auf die mit „1:50“ beschriftete Platte auf. Inokulieren Sie die Reinheitsplatten, indem Sie 50 Mikroliter des Inokulums aus dem TRTH mittels Pipette auf entsprechend beschriftete Blutagar- und 7H10-Platten übertragen und ausstrichen.

Dann stapeln Sie ein weiteres trth auf das beimpfte trth und legen Sie es vorsichtig in den Entsorgungsbehälter. Bringen Sie eine Klebeversiegelung auf der Mikrotiterplatte an. Drücken Sie dann mithilfe der weißen Unterlage fest auf jedes Loch, um eine ausreichende Versiegelung sicherzustellen, und achten Sie darauf, dass keine Falten entstehen.

Desinfizieren Sie die Mikrotiterplatte, indem Sie sie mit einem mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel getränkten Papierhandtuch abwischen. Anschließend stellen Sie die Mikrotiterplatte in eine Plastiktüte und verschließen diese mit einer Heißsiegelung. Desinfizieren Sie abschließend sämtliche Materialien, einschließlich der Nephi, des Vortexfilters, der Platten und Röhrchen, indem Sie sie mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel abwischen.

Hier wird Pro-Spray verwendet, nachdem genügend Zeit zur Sicherstellung der Desinfektion verstrichen ist. 15 Minuten für Pro-Spray. Die Platten werden mit Tesafilm abgeklebt, in Plastiktüten verpackt, und die versiegelten Materialien werden aus dem Sicherheitswerkbank entnommen und in den Durchreichebereich gebracht.

Der rote Entsorgungsbeutel wird an dieser Stelle geschlossen und mit einer Kabelbinder verschlossen; anschließend werden Kittel, Schuhüberzieher und Handschuhe ausgezogen. Nachdem man in den Vorraum gegangen und die Hände gewaschen hat, wird der Atemschutz entfernt, nach erneutem Händewaschen desinfiziert und aufbewahrt; danach wird ein neuer Kittel angelegt und die BSL-3-Einheit verlassen. Danach wird der Entsorgungsbehälter autoklaviert.

Im Anschluss inkubieren Sie die Mikrotiterplatte und die sieben H 10- und Blutaugerplatten in aufrechter Position im Brutschrank bei 35 bis 37 °C mit 5 bis 10 % CO2 im BSL-2-Labor. Dies ist akzeptabel, da die Platte gut verschlossen und in einer Plastiktüte verpackt ist. Die Generationszeit von Mycobacterium tuberculosis beträgt etwa 12 bis 24 Stunden, sodass es mindestens eine Woche dauern wird, bis Wachstum sichtbar ist, das sich als Zellpellet am Boden des Kontrollbrunnens zeigt. Am Tag 10 führen Sie eine manuelle Spiegelablesung durch, indem Sie die verschlossene a ST Mikrotiterplatte auf die Plattform der Spiegelbox legen.

Verwenden Sie eine Tischlampe, um das Wachstum besser sichtbar zu machen, und passen Sie gegebenenfalls an, um den besten Kontrast zu erzielen. Überprüfen Sie die Wachstumskontrollbrunnen, in diesem Fall H 11 und H 12, indem Sie in den Spiegel schauen. Bei Wachstum erscheint die Brunne trüb oder es liegt ein Sediment vor, wie hier gezeigt.

Wenn kein Wachstum vorhanden ist, wie in diesem Beispiel gezeigt, erscheint die Vertiefung klar. In diesem Fall stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator und inkubieren Sie weiterhin bis zu 21 Tage lang. Vergleichen Sie für jede Bedingung das Wachstum mit der Kontrolle.

Nun, für jeden Wirkstoffeintrag die erste Verdünnung, bei der kein Wachstum zu beobachten ist. Dies ist die minimale Hemmkonzentration oder MIC für den Wirkstoff. Um die Ergebnisse mithilfe eines automatisierten Plattenlesegeräts wie dem Vision zu untersuchen, öffnen Sie zunächst die Myco TB a ST Plate-Software und melden Sie sich an. Platzieren Sie die versiegelte Platte mit dem Barcode nach außen, wie hier gezeigt. Auf dem Computerbildschirm erscheint Wachstum als Trübung oder als Zellablagerung am Boden eines Wells.

Zunächst die Wachstumskontrollen untersuchen. Wie zuvor. Wenn kein Wachstum festzustellen ist, die Platte erneut für bis zu 21 Tage in den Inkubator stellen.

Falls dies positiv ist, notieren Sie die Ergebnisse, indem Sie das erste Loch berühren, das auf dem Bildschirm für jede Droge kein Wachstum zeigt. In einigen Fällen setzen sich Bakterien, Sediment oder Medikamente am Boden des Lochs ab. Dieses Phänomen, das als Schleppwirkung bekannt ist, zeigt sich durch mehrere Löcher mit Pellets gleicher Größe und wird nicht als tatsächliches Wachstum angesehen.

Anschließend werden die sieben H 10- und Blutagarplatten untersucht, um die bakteriellen Konzentrationen zu bestimmen und die Reinheit zu beurteilen. Auf der Blutagarplatte sollte nach 48 Stunden kein Wachstum sichtbar sein. Ein Wachstum auf der Blutagarplatte weist auf Kontaminationen mit schnell wachsenden Bakterien hin.

Wenn ein Wachstum vorliegt, muss der Mikrotiter-Test wiederholt werden. Auf der H 10-Reinheitsplatte sollte Wachstum eines einzigen Organismus zu beobachten sein. Mycobacterium tuberculosis sollte blassbraun, gefärbt, faltig und rau erscheinen. Bei Kontamination muss der Mikrotiter-Test aus einer Reinkultur wiederholt werden.

Um die bakterielle Konzentration zu bestimmen, zählen Sie die Kolonien auf der H 10-Platte. Anschließend berechnen Sie anhand der Tabelle im beigefügten schriftlichen Dokument die Koloniezahlen. Mycobacterium tuberculosis wurde aus einer Patientenprobe kultiviert, und die Antibiotikaresistenz wurde wie in diesem Video beschrieben anhand der hier gezeigten Platte beurteilt, auf der 12 verschiedene Wirkstoffe in ansteigenden Konzentrationen vorhanden sind, wobei die höchsten Konzentrationen oben und die niedrigsten Konzentrationen unten liegen.

Die minimale Hemmkonzentration oder MIC des Wirkstoffs wurde durch die niedrigste Konzentration des Wirkstoffs angegeben, die kein Wachstum zeigte, und ist im hier gezeigten Bild mithilfe standardisierter Breakpoints, die vom Clinical and Laboratory Standards Institute festgelegt wurden, umkreist. Die hier gezeigten Daten deuten darauf hin, dass dieser TB-Stamm resistent gegenüber Isid und Rifampicin sein wird. In vitro deuten die hohen MIC-Werte, die bei mehreren anderen Wirkstoffen beobachtet wurden, einschließlich Oin, Moxifloxacin, Streptomycin und Rifabutin, auf eine Resistenz des EM-Tuberkulose-Stamms gegenüber diesen Substanzen hin.

Die MIC-Ergebnisse sollten von einem auf die Behandlung von Tuberkulose erfahrenen Spezialisten für Infektionskrankheiten genutzt werden, um einen individuellen Behandlungsplan zu erstellen. Sobald die Methode beherrscht ist, dauert die Einrichtung eines Isolats etwa 40 Minuten. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass es sich hierbei um einen respiratorischen Erreger handelt und nach dem Auftragen Aerosole entstehen können. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis mithilfe der Mikrobrühenverdünnungsmethode durchgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mycobacterium tuberculosis äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Atemschutz stets getroffen werden sollten, wo dies erforderlich ist.