Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die lokale funktionelle Organisation hemmender neuronaler Schaltkreise zu untersuchen. Das Verfahren beginnt mit der Herstellung von lebenden Hirnschnitten aus dem primären somatosensorischen Kortex von Mäusen. Der nächste Schritt ist die Visualisierung und Ableitung von gezielten, GFP-exprimierenden hemmenden Zelltypen im Gehirnschnitt.

Nach dieser laserbasierten photochemischen Stimulation mittels Glutamat wird die Umcapselung genutzt, um kleine Gruppen präsynaptischer Neuronen als erregend oder hemmend zu aktivieren. Postsynaptische Ströme werden in den GFP-exprimierenden Interneuronen registriert. Der letzte Schritt besteht darin, die photochemische Stimulation und die Datenanalyse durchzuführen und quantitative Karten der synaptischen Eingänge zu den aufgezeichneten Neuronen zu erstellen.

Letztendlich ermöglicht die Kombination der lasergestützten Raster-Photo-Stimulation mit Ganzzell-Aufzeichnungen die Erstellung detaillierter Karten synaptischer Eingänge an spezifische Typen inhibitorischer Neurone, was zur Bestimmung der Organisation und Funktion lokaler inhibitorischer kortikaler Schaltkreise beitragen kann. Die auf Photo-Stimulation basierende Technik wurde von Dr. Larry Katz und Ned Calloway entwickelt und später von Dr. Carols Waboda, meinem Doktorvater, weiter ausgebaut. Dr. Xing Z wurde bei Dr. Calloway am Salk-Institut ausgebildet, wo er zahlreiche Studien zur Untersuchung interoraler Schaltkreise leitete. Unsere Arbeitsgruppe erweitert und führt derzeit diese Untersuchungen fort, um interorale Schaltkreise weiter zu erforschen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, opfern Sie eine transgene Maus im Alter von zwei bis drei Wochen nach der Geburt durch Enthauptung und entfernen Sie schnell das Gehirn, das Sie in eine gefrorene und mit Sauerstoff angereicherte Schntlösung legen. Verwenden Sie dann die GFP-Brille, um das Gehirn visuell auf GFP-Expression zu überprüfen. Anschließend schneiden Sie den primären somatosensorischen Kortex mit einem Vibratom in Schnitte von 400 Mikrometer Dicke.

Die Schnitte in der mit 95 % O2 und 5 % CO2 gesättigten, Saccharose enthaltenden aCSF bei 32 Grad Celsius 30 Minuten bis eine Stunde inkubieren. Danach die Schnitte in die reguläre aCSF bei Raumtemperatur überführen, um den Laser für das Experiment vorzubereiten: das Lasersystem einschalten, die Laserkühlung sowie die Stromversorgung aktivieren. Anschließend alle Hardware-Komponenten für die Lichtstimulationssteuerung einschalten, einschließlich des Scanning-Spiegel-Systems, des optischen Modulators, des elektronischen Verschlusses und eines Photodioden-Eingangsverstärkers.

Schalten Sie anschließend die elektrophysiologische Ausrüstung wie den Multi-Clamp-700-B-Verstärker und die Mikromanipulatoren ein. Elektrophysiologische Ableitungen, photostimulation und Bildgebung werden in der Schnelldurchflusskammer durchgeführt, die auf dem motorisierten Mikroskoptisch montiert ist. Danach schalten Sie die Bildgebungskamera ein, und das Schnittpräparat wird im aufrechten Mikroskop mit Infrarot-DIC und epifluoreszierender Optik über das Bildgebungssystem sichtbar gemacht.

Öffnen Sie dann die auf MATLAB basierende FS-Software und die Q-Capture-Kamera-Software auf dem Monitor. Überprüfen Sie vor dem Durchführen des Experiments das Laser-Photo-Stimulations-System und stellen Sie sicher, dass es betriebsbereit ist. Legen Sie ein Stück Papier unter das Vierfach-Mikroskopobjektiv, um das Laserscannmuster zu beobachten, während das System läuft.

Um die Mikroelektrode mit einem Widerstand von vier bis sechs Megaohm herzustellen, ziehen Sie eine Glaselektrode mit dem Pipettenzug. Füllen Sie anschließend die Elektrode mit einer intrazellulären Lösung, die 0,1 % Biotin zur Zellmarkierung und morphologischen Identifizierung enthält. Schalten Sie danach das Druck-perfundierte Perfusionssystem ein, um aCSF in die Kammer zu pumpen.

Stellen Sie sicher, dass sich eine konstante Flüssigkeitshöhe von 2,0 Millimetern über dem Schnitt im Kammer befindet. Eine Aliquot aus der Stammlösung von MNI-gefangenem Glutamat wird zu 25 Milliliter zirkulierendem A-CSF gegeben, um eine Konzentration von 0,2 Millimolar gefangenem Glutamat zu erreichen. Danach wird ein Gehirnschnitt in die Ablesekammer überführt.

Führen Sie die Bildgebung durch, um die Schnittqualität zu überprüfen und den primären somatosensorischen Bereich anatomisch zu lokalisieren. Befestigen Sie anschließend den Schnitt mit einem speziell angefertigten gefederten Platindraht, und achten Sie darauf, den Halter nicht über dem Gehirnareal anzubringen, das für die Ableitung vorgesehen ist. Visualisieren Sie die Zellen mit einem 60×-Objektiv anhand der GFP-Expression unter einem DIC-Fluoreszenzmikroskop.

Identifizieren und selektieren Sie die inhibitorischen Zelltypen. Beachten Sie, dass die Aufnahme unter visueller Kontrolle mithilfe der Infrarot-DIC-Technik durchgeführt wird. Eine Videoüberwachung und der Wechsel zwischen DIC- und Fluoreszenzmodus sind erforderlich, um die Position der GFP-Zelle zu bestätigen, während die Elektrode zur Zielzelle abgesenkt wird.

Mithilfe der herkömmlichen Patch-Clamp-Technik. Zunächst positiven Druck auf die Elektrode ausüben. Diese in die Nähe der Zelloberfläche bewegen, um eine erkennbare Delle auf der Zielzellmembran zu erzeugen.

Anschließend schnell negativen Druck anlegen, um eine Giga-Seal zu bilden und in die Zelle einzudringen, wobei die Reaktionen auf die Strominjektion am Videomonitor überwacht werden. Sobald der Zugang hergestellt ist, nehmen Sie Bilder des aufgezeichneten GFP-exprimierenden Intra-Neurons bei 60-facher Vergrößerung im DIC- und Fluoreszenzmodus zur Online-Verifizierung auf. Bevor die Daten zur Lichtstimulation gesammelt werden, hyperpolarisierende und depolarisierende Strompulse injizieren, um die grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften jeder Zelle zu untersuchen.

Wenn eine stabile Ganzzell-Aufnahme mit gutem Zugangswiderstand erreicht ist, der gewöhnlich unter 20 Megaohm liegt, wechseln Sie das Mikroskopobjektiv von 60× auf 4× Vergrößerung für die laserbasierte optogenetische Stimulation, nehmen Sie ein Schnittbild bei 4× Vergrößerung auf und verwenden Sie dieses zur Führung und Registrierung der Stimulationsstellen. Stellen Sie die Parameter für die optogenetische Stimulation und die Datenaufnahme ein, indem Sie das Konfigurationsschaltmodul von phys aktivieren. Verwenden Sie einen ein Millisekunden langen Laserimpuls mit einer Leistung von etwa 20 Milliwatt und einem Stimulationsintervall von einer Sekunde.

Erwerben Sie für die photoelektrische Stimulationskartierung Datenaufzeichnungen von einer Sekunde Dauer, die mit 10 Kilohertz abgetastet werden. Laden Sie anschließend das Bild der vier x-Schnitte in das Mapper-Modul von phys. Definieren Sie die Position des Soma und legen Sie die photoelektrischen Stimulationsstellen in einem 16 mal 16-Muster mit 80 µm mal 80 µm fest.

Abstand um die Zellposition, der alle kortikalen Schichten umfasst. Anschließend wird das Anregungsprofil des aufgezeichneten Neurons abgebildet, indem die Aktionspotential-Lokalisationen als Reaktion auf die Photoanregung im Strom-Klemm-Modus untersucht werden. Unsere benutzerfreundliche Software mit Online-Anzeigefunktionen erleichtert die Abbildungsexperimente.

Danach kartieren Sie die lokalen erregenden Schaltkreisverbindungen, indem Sie die erregenden postsynaptischen Ströme von der aufgezeichneten Zelle detektieren. Halten Sie bei Laserabtastung an verschiedenen Positionen die Zelle im Spannungsclamp-Modus bei minus 70 Millivolt, um einwärts gerichtete erregende Ströme nachzuweisen. Wiederholen Sie anschließend die Karten der erregenden postsynaptischen Ströme zwei bis drei Mal, wobei das photostimulative Muster rotiert oder gespiegelt wird. Um die lokalen hemmenden Schaltkreisverbindungen abzubilden, detektieren Sie die hemmenden postsynaptischen Ströme aus der aufgezeichneten Zelle.

Halten Sie die Zelle in diesem Fall nahezu bei null Millivolt, konkret bei minus 15 Millivolt, im Spannungs-Klemm-Modus, um nach außen gerichtete hemmende Ströme nachzuweisen. Nach Abschluss aller physiologischen Assays entfernen Sie die Elektrode vorsichtig von der aufgezeichneten Zelle. Entnehmen Sie die Gehirnschnittprobe aus der Kammer, fixieren Sie sie über Nacht in 4 % Paraformaldehyd und färben Sie die aufgezeichneten Zellen gegen Biotin an.

In diesem Experiment werden die Kombination der GFP-Expression, der intrinsischen Elektrophysiologie und morphologischer Merkmale zur Klassifizierung der hemmenden Neuronen verwendet. Gezeigt sind hier das Beispiel und eine Karte der Rohdaten, um die lasergestützte fotoelektrische Stimulation zu veranschaulichen, die eine umfassende Abbildung lokaler kortikaler Schaltkreisverbindungen zum aufgezeichneten hemmenden Neuron ermöglicht. Hier sind Beispiele für die farbkodierten quantitativen Eingangskarten, die aus den gerade in Abbildung D gezeigten Rohsignalen abgeleitet wurden. Die Amplituden der in dem aufgezeichneten Interneuron detektierten synaptischen Ereignisse sind farbkodiert und topographisch überlagert auf die Positionen der fotoelektrischen Stimulation dargestellt.

Die Position des Zellkörpers ist durch den roten offenen Kreis in der Maßstabsleiste gekennzeichnet. Warme Farben zeigen starke synaptische Eingänge an, während kalte Farben schwache oder keine Konnektivität mit der Zielzelle anzeigen. Abbildung E zeigt entsprechend die Anzahl der synaptischen Ereignisse pro abgetasteter Uncaging-Stelle an das aufgezeichnete Neuron.

Abbildung F zeigt die Latenzzeit des ersten nachgewiesenen synaptischen Ereignisses bis zur Aufzeichnung der Zelle nach photochemischer Stimulation an der Maßstabsleiste. Warme Farben deuten kurze Eingänge und Latenzen an, kühlere Farben weisen auf längere synaptische Latenzen hin. Somit ermöglicht LSPS die Erstellung detaillierter Karten zur Position, Stärke, Latenz und Anzahl von Eingängen, die auf bestimmte Typen hemmender Neuronen wirken.

Nun, bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, geduldig zu sein, saubere Versuchsbedingungen zu schaffen und die Neuronen effektiv und sehr sorgfältig vom Objekt mit hoher Vergrößerung auf niedrigere Vergrößerung umzustellen. Danach sollte die Analysesoftware abschließend sehr gut genutzt werden.