Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe optischer Falle in Kombination mit Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen in Echtzeit zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Pathogene einer Kammerobjektträgerplatte hinzugefügt werden. Anschließend wird ein Partikel ausgewählt und mittels der optischen Falle eingefangen.

Schließlich wird das Partikel auf die gewünschte Zelle gelenkt. Wie hier zu sehen ist, kann das optische Fangen eine wirksame Methode zur Steuerung von zwei Partikeln zur Beobachtung dynamischer intrazellulärer Wechselwirkungen sein.

Diese Methode kann wichtige Fragen zu Wirt-Pathogen-Interaktionen in den Bereichen Infektionskrankheiten und Immunologie beantworten, beispielsweise welchen Einfluss die vollständige Kontrolle der räumlichen Beziehungen zwischen Wirtszellen und Pathogenen auf die Phagozytose hat sowie, ob die Reihenfolge, in der Pathogene von einer phagozytierenden Zelle aufgenommen werden, die Phagolysosomen-Maturierung beeinflusst. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die Fangbedingungen für verschiedene Zell- und Kügelchentypen optimiert werden müssen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, insbesondere für den Prozess des Aufbaus und der Integration einer rotierenden Scheibe.

Ein Konfokalmikroskop mit einer optischen Falle ist aufgrund der präzisen Ausrichtung, die für alle optischen Komponenten erforderlich ist, schwer vorstellbar. Gewinnen Sie den gewünschten Erreger. Beispielsweise werden hier 300 Mikroliter Candida albicans, die über Nacht in Brühe kultiviert wurden, aus der Kultur entnommen und die Erreger in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen überführt.

Anschließend die Pathogene dreimal bei etwa 1300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur waschen, indem das Überstandsvolumen abgesaugt wird und das Pellet jedes Mal ungestört in PBS resuspendiert und sonifiziert wird. Nach dem dritten Waschschritt das Pellet in 500 Mikroliter PBS resuspendieren. Danach ein Milligramm des Farbstoffs von Entrust in 100 Mikroliter Dimethylformamid auflösen, um eine Endkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter zu erhalten.

Anschießend drei Mikroliter der Farbstoffmischung zu dem Reaktionsröhrchen mit den gewaschenen Erregern hinzufügen. Die Röhrchen mit Folie umwickeln, da die Farbstoffe lichtempfindlich sind, und die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius schütteln. Danach die Probe pelletieren und dreimal wie zuvor in PBS waschen. Nach der letzten Wäsche das Pellet in 300 Mikrolitern PBS resuspendieren.

Erwärmen Sie das Medium und PVS auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Waschen Sie eine mit RAW 264,7-Makrophagen beschichtete 10-Zentimeter-Zellkulturschale zwei Mal mit PBS, wobei Sie das PBS zwischen den Waschschritten abpipettieren. Anschließend bedecken Sie die Schalenoberfläche mit fünf Milliliter Trypsin und inkubieren die Schale fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Dann vorsichtig die Seite der Platte antippen, um die Zellen von der Plattenoberfläche zu lösen, wobei darauf geachtet werden sollte, dass das Trypsin nicht außerhalb der Platte verspritzt. Nun fünf Milliliter Medium zur Platte hinzufügen und die Mischung in ein Reaktionsröhrchen überführen.

Nach dem Pellettieren saugt man das Medium ab, wobei man vorsichtig ist, das Pellet nicht aufzuwirbeln, und resuspendiert das Pellet in 10 Milliliter Medium. Fügt man 400 Mikroliter Medium in jede Kammer einer Kammerobjektträger hinzu und gibt dann fünf Mikroliter der Zellsuspension in jede Kammer. Man lässt die Zellen über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 wachsen.

Entnehmen Sie die Kammerplatte aus dem Inkubator und pipettieren Sie fünf bis 10 Mikroliter der zuvor hergestellten, fluoreszenzmarkierten interessierenden Pathogene in jede Kammer mit Makrophagen. Mischen Sie Makrophagen und Pathogene gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, wobei darauf zu achten ist, den Boden der Kammer nicht zu berühren und die anhaftenden Makrophagen nicht zu stören. Schalten Sie alle Komponenten des Spinning-Disk-Konfokalmikroskops ein.

Bereiten Sie das Mikroskop vor, indem Sie Öl auf das Öl-Immersion-Objektiv geben. Führen Sie den Kammer-Objektträger in die spezielle Halterung ein und entfernen Sie danach die Abdeckung des Kammer-Objektträgers, um das Mikroskop für die DIC-Aufnahme einzurichten. Schalten Sie den Verschluss für die optische Falle und den IR-Laser ein.

Öffnen Sie dann den Verschluss des Lasers für die optische Falle. Überprüfen Sie mithilfe der IR-Karte, ob der Verschluss vor dem IR-Laser geschlossen ist. Fokussieren Sie nun auf die Makrophagen auf dem befestigten Objektträger.

Danach finden Sie die frei in der Lösung neben den Makrophagen schwimmenden Krankheitserreger. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, das richtige Objekt in der Probenkammer zur Verfolgung auszuwählen, da zwischen dem Objekt und dem Deckglas in der Probenkammer Adhäsionskräfte wirken. Um dieses Objekt zu bewegen, müssen Sie den Objekttisch verschieben, während das Objekt durch den Fanglaser gehalten wird. Außerdem ist zu beachten, dass der Objekttisch langsam genug bewegt werden muss, sodass die Strömungskraft des Objekttischs die maximale Fangkraft der Falle nicht überschreitet.

Bewegen Sie den Objekttisch so, dass sich der Erreger in der Nähe der Falle befindet. Öffnen Sie dann den Verschluss und aktivieren Sie die Falle. Bewegen Sie die Probe, um die Makrophagen mit einem stationär gefangenen Erregerbild in Kontakt zu bringen.

Die Erreger wurden mit einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop entweder in DIC-Fluoreszenz oder einer Kombination aus beidem abgebildet, wobei separate Populationen von Candida albicans, die typischerweise etwa fünf Mikrometer groß sind, grün, blau und rot markiert wurden. Zur Veranschaulichung der Bildgebung wurde ein einzelnes C. albicans eingefangen und entlang eines quadratischen Musters durch einen Cluster anderer Hefezellen bewegt, wie durch die grauen Pfeile angezeigt, was die Fähigkeit demonstriert, einen vom Bediener gezielt ausgewählten einzelnen Erreger auch in einer dichten Umgebung gezielt zu erfassen und an eine bestimmte Position zu bringen. Um die Flexibilität dieses Systems weiter zu verdeutlichen, einzelne Erreger mit unterschiedlichen Formmorphologien einzufangen, wurde in dieser Abbildung das optische Pinzettensystem verwendet, um ein C. albicans-Partikel mit einer Pseudohyphenstruktur zu halten und zu positionieren.

C. albicans ist mit rotem Farbstoff markiert und entlang einer Bahn bewegt worden, die durch den weißen Pfeil dargestellt ist, und neben fluoreszierende GFPL C3-Rohzellen platziert worden. In grün. Der Hefeteil von albicans wurde festgehalten, während der Pseudohyphenzweig entlanglief.

Aspergillus fum-Göttin wurde ebenfalls neben eine rohe Maus-Makrophagenzelle positioniert, um den absoluten Zeitrahmen der Phagozytose mit dieser spezifischen Zelllinie und diesem Pathogen zu analysieren. In dieser Abbildung zeigen Hellfeldaufnahmen, wie der eingefangene Aspergillus, wie durch den weißen Pfeil angezeigt, entlang des durch den roten Pfeil gekennzeichneten Weges bewegt und positioniert wurde. Der eingefangene Erreger ist aufgrund des Fallenmechanismus, der den Organismus leicht über die Fokusebene hinausdrückt, leicht unscharf.

Aspergillus wurde so lange bewegt, bis es neben der gewünschten rohen Zelle positioniert war. Sobald der Erreger Kontakt mit der Zelle aufnahm, wurde die Falle abgeschaltet. Der Phagozytosevorgang wurde aktiviert, und mittels Zeitrafferaufnahmen wurden die anschließenden zellulären Ereignisse beobachtet.

Bei 30 Sekunden begann die Membran der rohen Zelle, sich zu verändern und eine Mulde um das Partikel zu bilden. Bei 60 Sekunden war die Mulde vollständig ausgebildet. Zwischen 90 und 150 Sekunden wurde das Afu Gotti eingeschlossen und eingeschleust, und bis 180 Sekunden war das Partikel vollständig internalisiert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine optische Falle mit rotierender Scheibe aufbaut und wie ein solches Instrument eine nichtinvasive Steuerung von Pathogenen für die Live-Cell-Abbildung nach ihrer Entwicklung ermöglicht. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktionen den Weg, um die Rolle räumlicher Beziehungen zwischen Wirtszellen und Pathogenen sowie deren Einfluss auf die anschließende Immunantwort zu untersuchen.