Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Techniken besteht darin, embryonales Gewebe zu markieren und zu kultivieren, um morphogenetische Verformungen während der frühen Entwicklung zu messen. Für die Kultur des frühen Hühnerembryos beginnen Sie damit, das Embryo mithilfe einer Filterpapierschleppermethode aus dem Ei zu entfernen. Markieren Sie das gewonnene Embryo je nach experimenteller Anwendung mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen, die über magnetische Eisenteilchen zugeführt werden, oder mit Polystyrol-Mikrosphären. Verfolgen Sie anschließend die Markierungen während der Kultur mittels Fluoreszenzmikroskopie oder optischer Kohärenztomographie-Bildgebung.

Abbildungen der resultierenden morphogenetischen Dehnungskarten zeigen Bereiche der Gewebeverlängerung, -verkürzung und -scherung in zwei und drei Dimensionen. Hallo, mein Name ist Ben Philis und ich bin Doktorand im Labor von Dr. Larry Tabor am Department für Biomedizinische Technik der Washington University in St. Louis. Vor Beginn dieser Art von Experimenten ist es wichtig, die relevanten Gewebekulturmethoden in Ihrem Modellsystem, die Ihnen möglicherweise zur Verfügung stehenden Bildgebungsmodalitäten sowie die Art der Daten, die Sie aus Ihren Experimenten gewinnen möchten, zu berücksichtigen.

Zum Beispiel: Interessieren Sie sich für die Analyse von Gewebedeformationen in zwei oder drei Dimensionen? Wir gehen heute einigen dieser Fragen nach, indem wir zwei sich ergänzende Markierungstechniken im frühen Hühnerembryo vorstellen. Hallo, mein Name ist Victor Varner, und ich arbeite im Labor von Dr. Larry Tabor an der Washington University in St. Louis.

Bei beiden Techniken markieren wir schnell und gleichzeitig Hunderte von Zellen im frühen Hühnerembryo. Die Verfolgung der Bewegung dieser Markierungen ermöglicht es uns, nicht nur die Gewebe zu bestimmen, in die diese Zellen schließlich einwandern, sondern auch die gewebsweiten Deformationen zu quantifizieren, die das frühe Embryo formen. Inkubieren Sie die Eier zunächst in longitudinaler Orientierung bis zum gewünschten Stadium, wie von Hamburger und Hamilton definiert.

Zerschlagen Sie die Unterseite des Eies an der Seite einer 150 Millimeter großen Petrischale. Öffnen Sie die Schale von unten, geben Sie den Inhalt des Eies in die Schale und entfernen Sie mit stumpfen Pinzetten das dickere, viskose Eiweiß vom Eigelb. Stanzen Sie nun Löcher durch die Mitte eines runden Filterpapiers.

Platzieren Sie einen der Filterpapierringe auf dem Eigelb, sodass der Embryo durch das zentrale Loch des Ringes sichtbar ist. Schneiden Sie mit einer Mikroschere entlang des äußeren Randes des Filterpapierringes. Entfernen Sie dann das Papier mit dem daran haftenden Embryo vorsichtig vom Eigelb mit feinen Pinzetten und tauchen Sie den Embryo sanft in eine PBS-Lösung ein. Um anhaftende Eigelbpartikel zu entfernen, überführen Sie die Filterpapieranordnung in eine 35-Millimeter-Kulturschale.

Legen Sie es mit der Bauchseite nach oben und führen Sie das Embryo mit einem zweiten Filterpapier-Ring weiter. Sichern Sie es mit einem Metallring und tauchen Sie das Embryo in Kulturmedium ein. Wenn das Embryo nicht vollständig eingetaucht ist, können Geometrie des Gewebes und die anschließende Morphogenese durch abnormal hohe Oberflächenspannungsbelastungen stark verändert werden.

Während der Kultur unter Verwendung eines Hellfeldmikroskops die korrekte Morphologie und den embryonalen Entwicklungsstadium überprüfen. Zunächst eine kleine Menge Eisenpulver entnehmen, einige Tropfen gesättigte Farblösung und Alkohol hinzufügen und mit der Spitze einer gezogenen Mikropipette lufttrocknen lassen. Agglomerierte Eisenpartikel aufbrechen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Nach mehreren Spülgängen in ionisiertem Wasser wird das geerntete Embryo mit der dorsalen Seite nach oben in eine 35-Millimeter-Kulturschale gelegt, die mit einer reichlichen Schicht Kulturmedium bedeckt ist. Unter einem Stereomikroskop verwenden Sie die Glasnadel, um die Vilinmembran zu entfernen und die ekktodermalen Zellen freizulegen. Saugen Sie nun eine Säule markierter Eisenteilchen in eine Pipette auf.

Unter Verwendung des Stereomikroskops tauchen Sie die Pipette so ein, dass sie sich knapp über dem Embryo befindet. Rollen Sie die Pipette langsam zwischen den Fingerspitzen hin und her, um die Partikel über den Embryo zu verteilen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius entfernen Sie die Partikel mithilfe eines starken Magneten.

Falls erforderlich, den Magneten an eine magnetische Pinzette aus feinem Material anbringen und die magnetisierte Pinzette vorsichtig verwenden, um verbliebene Eisenpartikel zu entfernen. Fahren Sie fort, sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzbilder des Embryos aufzunehmen. Mit einer Nadel der Größe 22.

Ziehen Sie eine Lösung schwarzer Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern in PBS in eine 10-cc-Spritze ein. Danach werden die Spitzen der gezogenen Glasnadeln mithilfe einer Computer-Festplatte abgeschliffen und mit der Kügelchenlösung gefüllt. Klopfen Sie leicht gegen die Mikropipette, damit die Lösung mit einem Mikromanipulator bis zur Spitze vordringt.

Platzieren Sie die Glasnadel im gleichen Sichtfeld wie das Embryo. Bestätigen Sie den Fluss der Kügelchen aus der Pipettenspitze. Führen Sie nun die Pipettenspitze in das Lumen des Neuralrohrs ein.

Dabei darauf achten, den ventralen Boden des Gewebes nicht zu durchbohren. Überwachen Sie die vorübergehende Schwellung des Gewebes, während Perlen und Flüssigkeit in das Lumen eindringen. Entfernen Sie dann schnell die Glasnadel.

Überprüfen Sie abschließend eine ausreichende Perlen-Dichte im inneren Lumen des Gehirnschlauchs. Lassen Sie die Perlen unter dem Hellfeldmikroskop 20 bis 30 Minuten lang sedimentieren, bevor Sie Hellfeldaufnahmen oder einen optischen Kohärenztomographie-Datensatz aufnehmen. Nach der Aufnahme der ersten Bilder bringen Sie bis zu 7 Kulturschalen mit 35 Millimeter Durchmesser in eine Petrischale mit 150 Millimeter Durchmesser ein und stellen die gesamte Anordnung in einen kleinen Plastikbeutel.

Geben Sie Tropfen deionisiertes Wasser in die Tasche, um sie zu befeuchten, und füllen Sie die Tasche anschließend mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Stellen Sie die Embryonen bis zum nächsten Bildgebungszeitpunkt in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Platzieren Sie die markierten Embryonen in eine Delta-T-Schale, die 1,2 Milliliter Kulturmedium enthält, und decken Sie die Schale mit einem Glasdeckel ab, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Spülen Sie den Embryo mit einer Gasmischung aus 95 % O₂ und 5 % CO₂, die von einer Mini-Pumpe mit variabler Durchflussregelung bereitgestellt wird. Richten Sie die Software nun so ein, dass automatisch Bilder in gewünschten Zeitabständen aufgenommen werden.

Im Verlauf des Experiments können Markierungen automatisch oder manuell verfolgt und morphogenetische Dehnungskarten für die Koordinaten der Marker berechnet werden. Hier wurde die Eisenteilchen-Technik verwendet, um die Bewegung der elektrodermalen Zellen während der Kopffaltung zu markieren und zu verfolgen. Im frühen Hühnerembryo waren fluoreszenzmarkierte Zellen über das gesamte Embryo verteilt.

Helligkeits- und Fluoreszenzbilder des Embryos wurden in unterschiedlichen Intervallen während der Ex-ovo-Kultur aufgenommen. Um die Bewegungen der Traktmarkierungen zu überwachen. Kummulierte Daten ermöglichen die Berechnung der sich entwickelnden morphogenetischen Dehnungsverteilungen während der Bildung der Kopffalte.

Auf ähnliche Weise wurde die Polystyrol-Mikrokugel-Technik verwendet, um Gewebebewegungen an der Grenze zwischen Mittel- und Nachhirn im frühen Hühnergehirn zu verfolgen. Beachten Sie, dass diese Methode in der Lage ist, deutlich dreidimensionale Verformungen zu erfassen, da die Kugeln dazu neigen, an allen Seiten des inneren Lumens des Gehirns haften zu bleiben. Nach der Verfolgung der Kugelbewegungen über einen Zeitraum von sechs Stunden ermöglichen die Markerkoordinaten die Berechnung der Dehnungen und damit die Charakterisierung der Gewebeverformung in longitudinaler und umfassender Richtung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung von einigen der experimentellen Schritte haben, die erforderlich sind, um Ihre eigene Gewebekultur und Markierung durchzuführen. Die hier vorgestellten Protokolltechniken bieten den besonderen Vorteil, dass sie für das native Gewebe minimal invasiv sind und zudem kostengünstige sowie leicht verfügbare Materialien verwenden. Diese Experimente eignen sich besonders gut für Untersuchungen zur Mechanik der embryonalen Entwicklung.

Da die aus der verfolgten Bewegung markierter Zellen berechneten Deformationsfelder sowohl zur Überprüfung als auch zur Konstruktion physikalischer Modelle der Morphogenese verwendet werden können.