Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Boten-RNAs in einzelnen Neuronen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem einzelne Neuronen mit der Patch-Clamp-Technik fixiert und aufgezeichnet werden, anschließend wird das Zytoplasma jedes aufgezeichneten Neurons vollständig aspirationsentnommen, um sowohl das Mr.mRNA als auch das Zytoplasma zu gewinnen. Die CD-NA wird anschließend mittels PCR hergestellt und amplifiziert.

Schließlich können spezifische mRNA-Moleküle für Rezeptoren, Ionenkanäle und Enzyme mithilfe eines herkömmlichen Gelsystems zur Bildgebung nachgewiesen werden. Mein Name ist, ich arbeite am University of Tennessee Health Science Center. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Menge an mRNA in einem einzelnen Neuron äußerst gering ist und leicht verloren gehen kann.

Beginnen Sie dieses Protokoll damit, mithilfe eines Vibratoms Schnitte von 300 Mikrometer Dicke in koronaler Ebene herzustellen, die den mittleren rostral gelegenen Teil der Substantia nigra enthalten. Gehirne können von 15 bis 40 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten isoliert werden. Der Schneidevorgang erfolgt auf Eis in einer kalten Schnittlösung mit hohem Saccharosegehalt, die mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid oxygeniert und auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt ist. Inkubieren Sie die Schnitte in künstlichem zerebrospinalen Flüssigkeit, die mit einem Gasgemisch aus 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff durchblubbert wird.

Halten Sie die Temperatur bei 34 Grad Celsius und lassen Sie die Schnitte dort 45 Minuten lang. Danach bewahren Sie die Gehirnschnitte bei Raumtemperatur bis zur Ableitung auf. Beginnen Sie damit, einen Gehirnschnitt in eine Patch-Clamp-Ableitungskammer zu überführen.

Kontinuierlich mit oxygenierter künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit bei 32 Grad Celsius perfundiert. Füllen Sie die Patch-Pipetten mit autoklavierter intrazellulärer Lösung, die mit DNA- und RNA-freiem Wasser hergestellt wurde. Senken Sie eine beladene Pipette in das Bad ab.

Überprüfen Sie, ob der Widerstand zwischen zwei und drei Megaohm liegt. Lokalisieren Sie zuerst die Substantia nigra anhand ihrer charakteristischen und anatomischen Lage. Wählen Sie anschließend mithilfe von Namar-Optiken und einem 60×-Objektiv große Zellen im SNC und SNR zur Aufzeichnung aus.

Dies sind mögliche dopaminerge oder GABAerge Neuronen, ohne zu zögern. Verwenden Sie eine konventionelle Giga-Ohm-Dichtversiegelungs-Ganzzell-Konfiguration, um Strom- und Spannungsclamp-Messungen durchzuführen. Diese Ableitungen sollten im Allgemeinen innerhalb von weniger als fünf Minuten durchgeführt werden, um den mRNA-Abbau zu minimieren.

In etwa einer Minute ist es möglich, elektrophysiologische Fingerabdrücke für die gewünschten Neuronen zu erstellen, indem ausschließlich ihre Membran- und Aktionspotential-Eigenschaften aufgezeichnet werden. Nach der Datengewinnung aus einem gewünschten Neuron verwenden Sie sanften Mundabsaugdruck, um das Zytoplasma herauszusaugen. Der enge Verschluss sollte dabei nicht unterbrochen werden, andernfalls.

Extrazelluläre Trümmer, einschließlich mRNA, können in die Patch-Pipette eingesaugt werden und den Zellinhalt verunreinigen. Geben Sie den Zellinhalt durch Abbrechen der Pipettenspitze und Anlegen eines leichten positiven Drucks in eine 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen ab. Stellen Sie das Röhrchen anschließend unverzüglich in einen minus 20 Grad Celsius kalten Gefrierschrank, um eine Kontamination durch extrazelluläre Trümmer, die mRNA enthalten könnten, auszuschließen.

Erstellen Sie eine negative Kontrolle, indem Sie den Inhalt einer Patch-Pipette sammeln, die ohne Aspiration in das Gewebe abgesenkt wurde. Beginnen Sie unmittelbar nach der Sammlung des Zellinhalts von 10 bis 20 Neuronen die Reverse Transkription. Um den Abbau der mRNA zu minimieren, beginnen Sie mit dem Verdauen jeglicher kontaminierender genomischer DNA mittels DNase für fünf Minuten bei 25 Grad Celsius.

Dieser Schritt ist entscheidend, um potenzielle falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, und sollte nicht umgangen werden. Anschließend inaktivieren Sie die DNA durch Zugabe von 1,2 µL 25 mM EDTA und inkubieren die Proben bei 70 °C für fünf Minuten. Verwenden Sie nun ein handelsübliches Kit zur Synthese von cDNA, um zu überprüfen, ob die genomische DNA vollständig entfernt wurde.

Führen Sie eine Kontrollreaktion jeder Probe ohne Reverse Transkriptase durch. Dabei bleiben alle anderen Reaktionsbestandteile unverändert. Lagern Sie die Produkte bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für den PCR-Design benötigt werden.

Primer gemäß den Sequenzen in GenBank, wenn möglich, so gestalten, dass sie einen T-Intro-Überhang enthalten, um die Detektion von genomischer DNA-Kontamination zu erleichtern. Um die Wirksamkeit der Primer-Paare zu überprüfen, testen Sie diese im ersten Schritt an gesamter Gehirn-cDNA. Amplifizieren Sie mittels PCR fünf Mikroliter der 30 Mikroliter cDNA über 35 Zyklen unter Verwendung eines standardisierten Thermocycling-Protokolls.

Für die zweite Stufe führen Sie eine PCR-Amplifikation mit einem Mikroliter des PCR-Produkts aus der ersten Stufe unter Verwendung des gleichen Prime-Repair durch und verwenden ein leicht modifiziertes Zyklenprofil. Trennen Sie nun die Produkte in einem 2,5 %igen AGROS-Gel und visualisieren Sie sie mit AUM-Bromid oder Gel Green. Schneiden Sie unter UV-Licht die positiven DNA-Banden aus und sequenzieren Sie diese mithilfe eines im Handel erhältlichen Kits, um die DNA zu isolieren.

Die elektrophysiologischen Eigenschaften von Neuronen in der Substantia nigra, Pars compacta, und Pars reticulata wurden verglichen. GABAerge Neuronen des SNR wiesen eine höhere Frequenz spontaner Aktionspotentiale bei etwa 10 Hertz auf. Die Aktionspotentiale hatten eine Basisdauer von etwa einer Millisekunde nach Injektion eines hyperpolarisierenden Stroms.

SNR-GABAergen Neuronen zeigten eine subtile SAG-Antwort, was auf einen schwach aktivierten Strom hinweist. Im Gegensatz dazu wiesen die nigralen dopaminergen Neuronen spontane Spikes mit geringer Frequenz und einer Basisdauer von etwa drei Millisekunden auf. Dopaminerge Neuronen zeigten außerdem eine ausgeprägte SAG-Antwort auf Hyperpolarisation, was auf eine starke Expression des IH-Stroms in SNR-GABAergen Neuronen, jedoch nicht in dopaminergen Neuronen, hindeutet.

Die Einzelzell-R-T-P-C-R detektierte mRNA für Glutaminsäuredecarboxylase 1, ein Schlüsselenzym der GABA-Synthese. Im Gegensatz dazu wurde in identifizierten dopaminergen Neuronen des SNC und SNR, jedoch nicht in GABAergen Neuronen, mRNA für Tyrosinhydroxylase, ein Schlüsselenzym der Dopaminsynthese, nachgewiesen.

Anschließend wurde die Einzelzell-Echtzeit-PCR verwendet, um die Expression der spannungsaktivierten KV3-Kanaluntereinheiten zu untersuchen, die die Eigenschaften der spannungsabhängigen Kaliumkanäle verändern. Im Beispiel SNR GABA wurden in einem beispielhaften S-N-R-D-A-Neuron mRNAs für KV 3.1, 3.2, 3.3 und 3.4 nachgewiesen. KV 3.2, 3.3 und 3.4 wurden in den gepoolten Daten detektiert.

KV 3.1 wurde häufiger in SNR-GABAergen Neuronen nachgewiesen als in nigro-dopaminergen Neuronen, was auf eine höhere Expressionsstufe von KV 3.1 in den schnellen GABA-Neuronen des SNR hinweist. Während des Ablaufs dieses Verfahrens ist es wichtig, Handschuhe zu tragen und sicherzustellen, dass die Instrumente nach der Entwicklung keimfrei gehalten werden. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Expression und Funktion von Rezeptoren sowie der Ionenkanäle im Nervensystem zu untersuchen.