Isolation und Charakterisierung von Hoechst ^Low CD45 ^Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung von Wirt-Lungen-Mesenchymalen Stammzellen mit niedrigem CD45-Negativ-Ausdruck. Gewebe-residente mesenchymale Stammzellen oder MSCs sind wichtige Regulatoren der Gewebereparatur oder Regeneration, Fibrose, Entzündung und Angiogenese. Zunächst werden die Lungen von einem getöteten Maus entnommen.

Das Lungengewebe wird verdaut, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Zellen werden mit Hoax-Farbstoff und CD 45 markiert und mittels Durchflusszytometrie sortiert, um CD 45-negative, wirtseigene Lungens-MSCs zu gewinnen. Die Lungens-MSCs werden anschließend in Kultur vermehrt, und ein Koloniebildungs-Assay wird durchgeführt, um die Differenzierungsfähigkeit der MSCs zu bewerten.

Weitere Studien können dann durchgeführt werden, um die Rolle von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) während der Gewebehomöostase und bei Erkrankungen zu untersuchen. Die hier gezeigte Methode kann verwendet werden, um entweder murine oder humane mesenchymale Lungensamtammzellen zu isolieren, und ist auf die Untersuchung von Lungenerkrankungen wie pulmonaler Fibrose, pulmonaler Hypertonie und COPD anwendbar. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der Vielzahl verfügbarer Methoden zur Gewebepräparation sowie der Einrichtung geeigneter Kontrollen und der Analyse am Durchflusszytometer.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es schwierig ist, die korrekte Technik zum Zerkleinern und Verdauen des Lungengewebes für eine optimale Zellviabilität allein mit Worten zu beschreiben. Außerdem werden die Einrichtung und Analyse mittels Durchflusszytometrie am besten durch Demonstration vermittelt. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Lungen von einer getöteten erwachsenen Maus entfernen, die zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen verwendet werden sollen.

Verwenden Sie ein kleines Paar scharfer Scheren, um den Rippenkorb des Mäuses beidseits lateral zu durchtrennen. Öffnen Sie die Brusthöhle und entfernen Sie anschließend das Zwerchfell. Führen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer Nadel der Stärke 20,5 Gauge in den rechten Herzkammer vor und drücken Sie vorsichtig den Kolben nieder, um drei bis fünf Milliliter PBS durchzupumpen, wodurch das Blut aus den Lungen ausgespült wird.

Danach mit einer Schere die Luftröhre und die großen Bronchien abschneiden und entsorgen. Anschließend mit einer Pinzette die kleinen weißen Lungenlappen aufnehmen und in eine Petrischale geben, die mit Hank’s Buffered Saline oder HBSS gefüllt ist.

Entfernen Sie dann das Herz und trennen Sie die Lungenlappen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse der Studie. Überführen Sie die Lungenlappen in den Deckel der Schale.

Befeuchten Sie das Gewebe mit ausreichend HBSS, um Austrocknung zu verhindern. Zerkleinern Sie dann mit einem Einweg-Skalpell die Lungenlappen, um Knochenmark zu gewinnen, das als Erhaltungskontrolle für die Durchflusszytometrie verwendet wird. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um am Knöchel und am oberen Ende des Femurs zu schneiden.

Legen Sie das Glied in eine neue Petrischale. Schneiden Sie dann das Knie ab, sodass ein lineares Stück des Femurs und ein zweites Stück, das Tibia und Fibula enthält, übrigbleiben. Ziehen Sie mit einer Pinzette den Muskel ab, um Tibia, Fibula und Femur freizulegen.

Nehmen Sie nun eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 26½-Gauge-Nadel und führen Sie die Nadel in die Knochenmarköffnung ein. Halten Sie den Knochen an einem Ende der Tibia, während das andere Ende in ein 50-Milliliter-Kegelrohr gerichtet ist, das mit 15 Millilitern HBSS gefüllt ist, und drücken Sie den Kolben, um HBSS auszubringen und das Knochenmark in das Rohr auszuspülen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer Fibula und einem Femur.

Färben Sie das Knochenmark mit Wirt 3 3 3 4 2 bei einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter in ergänztem DMEM mit hohem Glucosespiegel. Als Nächstes wird eine Einzelzell-Suspension von Lungengewebe aus dem isolierten Gewebe hergestellt. Geben Sie jede Lunge in ein Gefäß mit vorgewärmtem 0,2 % Worthington.

Kollagenase Typ II in sterilem HBSS hergestellt, dann das Röhrchen in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius eintauchen und 30 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation die Probe mit einer 10-Milliliter-Pipette solange trituriert, bis der Verdauungsansatz leicht durch die Pipette fließt. Ungefähr 10 Wiederholungen durchführen und anschließend weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um den Gewebeverdau abzuschließen.

Nach Abschluss des Verdauungsschritts verdünnen Sie die Zellsuspension mit HBSS und verwenden Sie eine fünf Milliliter pipette, um erneut zu versuchen, alle verbleibenden Gewebefragmente zu dispergieren. Als Nächstes gießen Sie die Suspension durch einen 70 µm Zellfilter in ein 50 Milliliter kegelförmiges Reagenzglas, um unverdaute Gewebefragmente zu entfernen. Geben Sie die Suspension schrittweise hinzu, um sicherzustellen, dass die Probe kontinuierlich durch den Zellfilter fließt.

Wenn undigestierte Gewebefragmente den Durchfluss der Zellsuspension vollständig blockieren, durch einen neuen Zellfilter in ein neues Röhrchen gießen. Die Zellsuspension 10 Minuten bei 450 RCF pelletieren.

Nach der Zentrifugation das Überstand abgießen und das Zellpellet vorsichtig in Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen bei Raumtemperatur resuspendieren, fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend ein gleiches Volumen HBSS hinzufügen, um den Lysepuffer zu inaktivieren.

Geben Sie die Zellsuspension in einen 40-Mikrometer-Zellsieb, um Verunreinigungen und Zellaggregate zu entfernen, und sammeln Sie die Durchflussfraktion in einem neuen 50-Milliliter-Konischglas. Bestimmen Sie anschließend mit einem Hämozytometer die Zellzahlen für die Proben aus Lunge und Knochenmark. Notieren Sie die Konzentration und das Gesamtvolumen der Zellsuspension.

Sedimentieren Sie dann die Einzelzell-Suspension der Lunge durch Zentrifugation bei 450 RCF für 10 Minuten. Um die Zellen zu erhalten, resuspendieren Sie sowohl die Lungen- als auch die Knochenmarkzellen gleichzeitig in einer Konzentration von 10⁶ Zellen pro Milliliter in vorgewärmtem, supplementiertem DMEM mit hohem Glukosegehalt.

Um die DNA anzufärben, fügen Sie den HOAXED 3 3 3 4 2 Farbstoff in einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Liter hinzu. Mischen Sie anschließend die Zellen durch vorsichtiges Umstülpen und inkubieren Sie sie genau 90 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Danach zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 450 ×g und vier Grad Celsius nach dem Spin.

Fahren Sie mit der Färbung des Lungengewebes und Knochenmarkgewebes mit Anti-CD45 und Propidiumjodid zur Vorbereitung der Analyse per Durchflusszytometrie fort. Nach der Färbung der Zellen die Röhrchen vor Licht geschützt auf Eis lagern, bis die Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt wird. Bereiten Sie die Durchflusszytometrie vor, indem Sie sicherstellen, dass die Laser des Geräts justiert sind und es für das Zellsortieren eingerichtet ist.

Das verwendete Gerät muss mit blauen 488 Nanometer, roten 635 Nanometer und UV-Lasern im Bereich von 350 bis 355 Nanometer ausgestattet sein sowie über zwei Detektoren auf dem UV-Laserstrahlengang mit blauen 45 über 65- und roten 675 über 50-Filtern verfügen. Zusätzlich muss der UV-Rot-Detektor eine hohe Empfindlichkeit für das rote Signal aufweisen, und das Gerät muss mit einer Kühleinheit ausgestattet sein, um die Probe bei 10 Grad Celsius zu halten. Richten Sie in der Gerätesoftware Histogrammplots ein, um lineare Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung darzustellen, sowie einen Doublettdiskriminierungsplot, der für das Gerät geeignet ist.

Ein Histogramm-Plot von PI mit einem logarithmischen Signal, ein Rot gegen Blau-Plot mit linearen Signalen und ein Histogramm-Plot von CD45 APC mit einem logarithmischen Signal. Sobald das Gerät bereit ist, geben Sie die angefärbte Knochenmarkprobe in die Ladeöffnung des Geräts ein. Diese Probe dient als Kontrolle für die Färbung und die Geräteeinstellung.

Beginnen Sie mit der Erfassung von Ereignissen und passen Sie die linearen Signale des Vorwärtsstreulichts an. Um die Zellpopulation deutlich sichtbar zu machen, sollten sich die Zellen ungefähr im unteren Zentrum des Diagramms befinden, wobei die Vorwärtsstreuung auf der x-Achse dargestellt ist. Da der Kernfarbstoff PI membranimpermeant ist, wird er von lebenden Zellen ausgeschlossen.

Zeichnen Sie ein Gatter für den Gating-Bereich auf die PI-positiven toten Zellen im PI-Histogramm. Weisen Sie die Gerätesoftware an, die toten Zellen in diesem Gatter rot zu färben.

Es ist hilfreich, die farblich markierten, durchlässigen toten Zellen als Orientierungshilfe zu verwenden, um die Wirtspopulation in der G0/G1-Phase zu identifizieren. Die PI-Färbung wird ebenfalls durch den UV-Laser angeregt, und der Großteil der toten Zellen sollte über Skala liegen. Auf der rechten Seite des Plots der roten versus blauen Hoecsht-Fluoreszenz sollte die G0/G1-Population des Knochenmarks als enger Cluster von Ereignissen im Plot der roten versus blauen Hoecsht-Fluoreszenz sichtbar sein.

Stellen Sie die Detektorspannungen so ein, dass der G0-G1-Cluster in der oberen rechten Bildmitte angezeigt wird. Ein Teil der S-Phase und die gesamte G2-Phase des Zellzyklus können außerhalb der Skala liegen. In der oberen rechten Ecke des Plots mit rot gegen blau dargestellten Daten ist die Side-Population mit niedriger Intensität als Ausläufer von der linken Seite des G0-G1-Clusters bis in die untere linke Ecke des Plots zu erkennen.

Zeichnen Sie nun ein Tor um den Zellcluster im FSC-SSC-Diagramm. Stellen Sie die im Dublett-Diagramm identifizierte Einzelzellenpopulation und die lebenden Zellen im PI-Histogramm dar. Weisen Sie anschließend dem Hoax-Diagramm zu, nur diese torgefilterten Populationen anzuzeigen.

Nachdem der Host-Plot ausgewählt wurde, zeichnen Sie einen Bereich um die Side-Population. Weisen Sie diesen Bereich als Gate dem CD45-APC-Histogramm zusammen mit den Gates für Streulicht-Singuletts und lebende Zellen zu. Nachdem das System eingerichtet ist, nehmen Sie die Probe vom Ladeanschluss und setzen die Lungenprobe in den Ladeanschluss ein.

Die Instrumenteneinstellungen sollten für diese Probe nicht erneut angepasst werden müssen. Beginnen Sie mit der Erfassung von Ereignissen im Rot-gegen-Blau-Hoax-Diagramm. Der G0/G1-Cluster für die Lungenprobe erscheint gewöhnlich stärker länglich in Richtung der x-Achse und ähnelt dem Tilde-Symbol auf einer Tastatur.

Die Seitenpopulation Gait Hoax Low sollte sich in einer ähnlichen Position befinden wie die für die Knochenmarkprobe eingestellte. Geringfügige Anpassungen nach oben oder unten können erforderlich sein, um eine scharfe Auflösung der Seitenpopulation sicherzustellen. Halten Sie während des Sortierens einen niedrigen Druckunterschied aufrecht, indem Sie sicherstellen, dass das Probendurchflussventil nicht zu weit geöffnet wird.

Als Nächstes zur Isolierung von MSC eine 96-Loch-Sammelplatte in die Sortierkammer stellen und die Sortiertore im CD45-APC-Histogramm einstellen, um positive und negative Populationen zu trennen. Schließlich die Zellen entweder als gemischte Population in ein Reagenzglas oder als Einzelzellen zur Isolierung von Klonen in eine 96-Loch-Platte sammeln. Nach der Sammlung der Lungen-MSC durch Zellsortierung werden die Zellen in 30-Millimeter-Dishs mit MEM ergänzt durch 20 % FBS ausplattiert. Zunächst erscheinen sortierte Zellen klein, rund und hell, nach ungefähr zwei bis drei Wochen.

Kolonien mit dem mesenchymalen Phänotyp werden sichtbar und die Proliferation ist bei jeder Zellpräparation deutlicher. Beurteilen Sie die Fähigkeit der lungenspezifischen mesenchymalen Stromazellen (MSC), sich in die klassischen mesenchymalen Linien von Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, sowie deren Oberflächenexpression etablierter mesenchymaler Marker. Führen Sie eine zytogenetische Bandenanalyse durch, um das Fehlen grober chromosomaler Abnormalitäten zu bestätigen.

Nach der Isolierung mittels Durchflusszytometrie und der Erzeugung von Einzelzellklonen wird ein Koloniebildungsassay durchgeführt, um die MSC-Zellen und ihre Differenzierungsfähigkeit zu charakterisieren. Beginnen Sie mit Zellen, die auf drei mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter verdünnt wurden. In unvollständigem Kulmedium in 100-Millimeter-Dishs erfolgt eine serielle Verdünnung mit zwei mal 10 hoch vier, drei mal 10 hoch vier, 1,5 mal 10 hoch vier und 0,75 mal 10 hoch vier Zellen pro Dish in 10 Milliliter Medium, jeweils im Dreifachansatz.

Danach die Platten nach 10 Tagen Kultur in den Inkubator stellen, das Medium abgießen und die Zellen mit PBS spülen. Anschließend fixieren, indem 100 % Methanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur hinzugefügt wird. Nach fünf Minuten das Methanol abgießen.

Dann zur Detektion der Koloniebildung 0,4 % Gewicht pro Volumen GZA, verdünnt im Verhältnis 1 zu 20 mit ionisiertem Wasser, hinzufügen und 10 bis 15 Minuten inkubieren. Anschließend die Färbung abgießen und mit ionisiertem Wasser spülen. Die Proben lufttrocknen lassen und die Anzahl der Kolonien mit mehr als 25 Zellen pro Kolonie mithilfe eines invertierten Mikroskops oder einer Visualisierung quantifizieren.

Die Kolonien sind groß und bestehen aus einigen hundert Zellen, wie hier gezeigt, und weisen ein mesenchymales Phänotyp auf. Die MSCs wurden wie in diesem Video dargestellt isoliert und in 96-Well-Platten zur simulierten Vermehrung ausplattiert. Anschließend wurden die arrestierten, mit CFSE markierten antigenpräsentierenden Zellen den Lungen-MSCs hinzugefügt.

Die Proliferation isolierter MSCs wurde anschließend als Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität von CFSE im Vergleich zum Hintergrund gemessen, wobei der Hintergrund allein CFSE-markierte T-Zellen darstellte, wie in dieser Abbildung gezeigt, in Abwesenheit von Lungen-SZ und in Gegenwart von antigenpräsentierenden Zellen. A PC mit und ohne Ovoalbumin CD40-positive effektorische T-Zellen zeigen eine Abnahme der CFSE-Intensität, was eine Proliferation anzeigt, hervorgehoben durch rote Kreise. Die CFSE-Fluoreszenzintensität der T-Zellmembran nimmt bei jeder Zellteilung ökonomisch ab, d. h. die Hälfte pro Teilung. In Gegenwart von Lungen-M-S-C-A-P-C mit und ohne OVA zeigen CD40-positive beeinflusste T-Zellen keine signifikante Änderung der CFSE-Intensität, was auf einen Mangel an Proliferation nach ihrer Entwicklung hinweist. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Lungen-Stammzellbiologie den Weg, um die Rolle mesenchymaler Stammzellen bei Lungenerkrankungen wie pulmonaler arterieller Hypertonie und pulmonaler Fibrose zu untersuchen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa fünf Stunden nach dieser Anleitung durchgeführt werden. Andere Methoden wie Differenzierungsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die putativen mesenchymalen Stammzellen der Lunge eine geeignete multiliniale Differenzierung in Knochen-, Fett- und Knorpelgewebe aufweisen.