Teratom-Generation in den Hoden Capsule
7. November 2011
Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) haben das Potenzial, eine Vielzahl von verschiedenen Krankheiten zu behandeln. Die Nützlichkeit dieser Zellen besteht darin, dass sie in einem beliebigen Zelltyp im Körper zu unterscheiden. Hier beschreiben wir die Teratom-Assay, mit dem die Pluripotenz von hPSCs demonstrieren wird.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Pluripotenz zu überprüfen, indem Teratome in der Tunica albuginea von immundefizienten Mäusen mit menschlichen pluripotenten Stammzellen oder H PSCs erzeugt werden. Beginnen Sie damit, eine Kultur der zu testenden, potenziellen H PSCs zu gewinnen. Führen Sie anschließend eine Operation durch, um die Hoden der Maus freizulegen, und injizieren Sie die Zellen in die Hodenkapsel.
Platzieren Sie die Hoden sechs bis zwölf Wochen später an ihren ursprünglichen Ort und schließen Sie die Maus operativ. Untersuchen Sie den resultierenden Tumor histologisch auf das Vorhandensein von Zellen aus allen drei Keimblättern. Letztendlich kann nachgewiesen werden, dass eine HPSC-Linie tatsächlich pluripotent ist, indem gezeigt wird, dass sie sich in einem immundefizienten Mausmodell in Zellen aus allen drei Keimblättern differenzieren kann. Obwohl kürzlich neue Methoden zur Nachweis der Pluripotenz menschlicher Stammzellen beschrieben wurden, bleibt der Teratoma-Assay der Goldstandard in diesem Bereich. Die Darstellung des Verfahrens erfolgt durch Tron, einer leitenden technischen Assistentin in meinem Labor.
Bringen Sie die menschlichen pluripotenten Stammzellen bis zur Konfluenz und dissoziieren Sie dann die HPSEs mit Accutase. Zählen Sie die Zellen, um 1 Million HPCs pro Injektion erneut aufzuschwemmen. Rasieren Sie zunächst den Bauch von anästhesierten sechs Wochen alten männlichen Mäusen einer immundefizienten Mauslinie mit einem Schermesser. Reinigen Sie die Bauchvorderwand der Maus mit Povidon-Iodin-Lösung, beginnend in der Mitte des Bauchs und sich im Uhrzeigersinn nach außen bewegend.
Waschen Sie den rasierten Bereich anschließend dreimal mit 70 % Ethanol, wobei jedes Mal ein neuer Tupfer verwendet wird. Überführen Sie das Tier zur Durchführung des chirurgischen Eingriffs auf eine Heizplatte innerhalb einer sterilen Haube mit sterilen chirurgischen Scheren.
Führen Sie einen ein Zentimeter langen Längsschnitt durch die Haut und das Peritoneum direkt unterhalb des Hüftgelenks durch, wobei Sie das Peritoneum mit einer Pinzette festhalten. Greifen Sie mit einem weiteren Paar steriler Pinzetten in Richtung des rechten Hüftgelenks und ziehen Sie das weiße Fettgewebe zusammen mit den daran befestigten Hoden heraus. Befüllen Sie nun eine Ein-Kubikzentimeter-Tuberkulinspritze mit den zu injizierenden hPSCs und injizieren Sie langsam 20 bis 30 Mikroliter H-PSCs in die Mitte der Hodenkapsel, fernab von größeren Blutgefäßen.
Entfernen Sie die Nadel langsam mit einer Pinzette, um einen Rückfluss der Zellen zu vermeiden. Bringen Sie die Hoden und das Fettgewebe wieder in ihre ursprüngliche Position im Bauchraum zurück. Verschließen Sie das Peritoneum mit zwei oder drei resorbierbaren Nähten und die Haut mit Autoklammern.
Nach der Operation Analgetika nach Bedarf zweimal täglich verabreichen. Das Tier über einen Zeitraum von sechs bis zwölf Wochen auf tastbare Tumorbildung überwachen. Bei einer Tumorgröße von etwa fünf Millimeter den Tumor von der getöteten Maus entfernen, um ihn zu dokumentieren.
Fotografieren Sie den Tumor und messen Sie Größe und Gewicht. Anschließend schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke und fixieren ihn zur histopathologischen Untersuchung in einer 4 %igen Parafomaldehydlösung. Typischerweise wird nach sechs bis zwölf Wochen ein Teratom beobachtet.
In diesem Beispiel wurden eine Million menschliche WA oh nine pluripotente Stammzellen in die Hodenkapsel einer immungeschwächten Maus injiziert. Eine genaue Untersuchung des Teratoms zeigt Heterogenität und zahlreiche angeheftete Zysten. Wie erwartet.
Die histopathologischen Analysen weisen Zellen aus allen drei Keimblättern nach. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine positiv kontrollierte Zelllinie einzubeziehen, von der bekannt ist, dass sie ziemlich potent ist, um sicherzustellen, dass der Test korrekt durchgeführt wurde. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine klare Vorstellung davon haben, wie man bestimmt, ob eine humane Stammzelllinie pluripotent ist oder nicht.
Übersicht
In diesem Artikel wird der Teratoma-Assay beschrieben, eine Methode zur Beurteilung der Pluripotenz menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs). Bei diesem Assay werden hPSCs in die Tunica albuginea von immundefizienten Mäusen injiziert und die entstehenden Teratome anschließend auf ihre Differenzierung in verschiedene Zelltypen hin untersucht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Regenerative Medizin
- Histopathologie
Hintergrund
- Menschliche pluripotente Stammzellen können sich in jeden Zelltyp differenzieren.
- Die Teratombildung ist ein entscheidender Indikator für Pluripotenz.
- Der Test gilt als Goldstandard zur Nachweisung der Pluripotenz.
- Es existieren neue Methoden, doch der Teratoma-Assay bleibt weit verbreitet.
Zweck der Studie
- Nachweis der Pluripotenz von hPSCs durch Teratombildung.
- Vorstellung einer detaillierten Methodik zur Durchführung des Teratom-Assays.
- Herausstellung der Bedeutung der Verwendung einer positiven Kontrolle im Assay.
Verwendete Methoden
- Isolierung von hPSCs und Vorbereitung für die Injektion.
- Chirurgische Freilegung des Maustestes und Injektion von hPSCs.
- Überwachung des Tumorwachstums über sechs bis zwölf Wochen.
- Histologische Analyse des Teratoms auf Differenzierung in Keimblätter.
Hauptergebnisse
- Teratome bildeten sich sechs bis zwölf Wochen nach der Injektion.
- Die histopathologische Analyse bestätigte das Vorhandensein von Zellen aus allen drei Keimblättern.
- Zeigte die Wirksamkeit des Teratom-Assays zur Beurteilung der Pluripotenz.
- Schloss eine positive Kontrolle zur Validierung der Assayergebnisse ein.
Schlussfolgerungen
- Der Teratoma-Assay ist eine zuverlässige Methode, um die Pluripotenz von hPSCs zu bestätigen.
- Einwandfreie chirurgische Techniken und eine sorgfältige Überwachung sind entscheidend für erfolgreiche Ergebnisse.
- Zukünftige Studien könnten alternative Methoden neben den herkömmlichen Assays untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Der Teratoma-Assay liefert einen funktionellen Nachweis der Pluripotenz, indem er die Differenzierungsfähigkeit über alle drei Keimblätter hinweg in vivo demonstriert. Dieser Assay unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entwicklung stammzellbasierter Therapeutika. Er ermöglicht eine vorhersagbare Sicherheit bezüglich der zellulären Identität, bevor man zu präklinischen Modellen übergeht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Bestätigt Pluripotenz durch Nachweis der Differenzierung in Keimblätter der Ektoderm-, Mesoderm- und Endoderm-Linie.
- Operationaler Wert: Verwendet ein standardisiertes In-vivo-Modell, um falsch-positive Pluripotenz-Behauptungen zu reduzieren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen hinsichtlich der Eignung von Stammzelllinien für die therapeutische Entwicklung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative histopathologische Ergebnisse zur Darstellung der Keimblätter.
- Operativer Wert: Etabliert ein reproduzierbares Protokoll unter Verwendung einer Injektion in die Hodenkapsel bei immundefizienten Mäusen.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays zwischen verschiedenen Laboren für eine konsistente Testung der Pluripotenz.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Validiert das Entwicklungspotential von hPSCs vor der Differenzierung in linien-spezifische Vorläuferzellen.
- Operativer Wert: Erfordert die Überwachung über einen Zeitraum von 6–12 Wochen hinsichtlich Tumorbildung und eine histopathologische Analyse.
- Strategischer Wert: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Stammzelllinien in präklinische Wirksamkeitsstudien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Teratoma-Assay fungiert als Gatekeeping-Schritt im Kontinuum der Stammzellenforschung und ist zwischen der Aufrechterhaltung der Pluripotenz und der gezielten Differenzierung oder präklinischen Wirksamkeitsprüfung angesiedelt.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft die zentrale Hypothese der Pluripotenz, indem die Differenzierungskapazität in die drei Keimblätter bewertet wird.
- Screening: Erzeugt standardisierte Teratombildungsraten und histologische Bewertungen zur vergleichenden Beurteilung von Zelllinien.
- Analytik: Liefert keimblattspezifische Analyseergebnisse mittels histopathologischer Untersuchung, um das Differenzierungspotenzial zu quantifizieren.
- Translationale Forschung: Verbindet die Bestätigung der Pluripotenz mit nachgeschalteten Differenzierungsabläufen zur Herstellung krankheitsrelevanter Zellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Pluripotenzkontrolle für mehrere hPSC-Linien im therapeutischen Pipeline-Screening.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bezüglich der Identität von Stammzellen, indem die funktionelle Pluripotenz bestätigt wird.
- Operationaler Wert: Liefert standardisierte und reproduzierbare Ergebnisse durch definierte chirurgische und histologische Verfahren.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem nicht pluripotente Linien frühzeitig im Entwicklungsprozess ausgeschlossen werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikobasierte Priorisierung von Stammzelllinien für Investitionen in Differenzierung und Krankheitsmodellierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Chirurgie an Nagetieren und sterile Techniken für die Injektion in die Hodenkapsel.
- Setzt den Zugang zu immundefizienten Mausstämmen und Einrichtungen zur postoperativen Überwachung voraus.
- Erfordert eine histopathologische Infrastruktur zur Identifizierung der Keimblätter in Teratom-Schnitten.
- Beinhaltet ethische Überwachung und Genehmigung durch die IACUC für den Tierversuch im Rahmen von Tumorigenitätsassays.
- Eingeschränkt durch den Zeitraum von 6–12 Wochen, der iterative Screening-Kampagnen verlangsamen kann.
