Zell-Capture mit einer mikrofluidischen Vorrichtung

Die Geräte, wie wir sie hergestellt haben, werden in Kits zu je 10 oder 20 Stück verpackt, und sobald sie eintreffen, werden sie gekühlt in einer Box geliefert. Das Kit enthält alle Komponenten, die Sie für die Durchführung benötigen. Im Kit befindet sich ein Experiment, das aus einem Paket mit allen Spritzen und Puffern besteht, das bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann. Außerdem liegt eine Kopie des Protokolls bei, dem wir in diesem Experiment folgen werden.

Es gibt außerdem eine gekühlte Box, die die eigentlichen Geräte und alle Laufpuffer enthält, die gekühlt werden müssen. Typischerweise werden die Kits in Gruppen von 10 oder 20 verpackt. Wenn sie nicht verwendet werden, sollten die Kits gekühlt aufbewahrt werden.

Jede Spritze und jedes Bestandteil des Kits ist sorgfältig beschriftet, und die Beschriftungen entsprechen der Tabelle im Protokoll, dem wir folgen. Es besteht daher keine Unklarheit darüber, welche Spritze oder welcher Kit-Bestandteil in den einzelnen Schritten verwendet werden soll. Nach dem Auspacken der Geräte und deren Platzierung in einem biologischen Sicherheitswerkbank werden wir das Verfahren zur Isolierung der Neutrophilen durchführen und diese für nachgeschaltete genomische Anwendungen lysieren, da die Lebensretter, die wir erhalten, zur Isolierung verwendet werden oder wir die RNA aus dem Zelllysat extrahieren werden.

Deshalb möchten wir sicherstellen, dass unser Arbeitsbereich sauber ist, nicht nur im sterilen Sinne, sondern auch frei von jeglicher RNA, die typischerweise in der Umgebung vorhanden ist. Daher ist es sehr wichtig, den gesamten Bereich und alle Geräte mit einer Lösung abzuwischen, die RNA zerstört. Üblicherweise wischen wir alle unsere Werkzeuge und Arbeitsflächen mit RNA SAP oder RNAs away ab, die Sie von einer Reihe von Herstellern beziehen können.

Das Gerät wurde in einer hitzeversiegelten Folienverpackung geliefert. Jedes Gerät ist versiegelt und mit einem Barcode versehen. Sie sollten diesen Barcode notieren, wenn Sie mit klinischen Proben arbeiten.

Die Vorrichtung ist also offen, der Deckel wird abgenommen und sie wird in die Haltevorrichtung des Pumpensystems eingesetzt. Die verwendete Blutprobe ist eine Probe Vollblut. Wir werden sie durch die standardmäßige Ein-Milliliter-BD-Spritze leiten, die als Spritze eins gekennzeichnet ist.

Üblicherweise wird die Spritze aus der Verpackung genommen und die Kappe vorsichtig von dem Blutröhrchen entfernt. Anschließend gibt man 700 Mikroliter oder 0,7 Milliliter Blut ab und injiziert die Hälfte davon, also 350 Mikroliter, in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Auf diese Weise kann Ihr Blut für die weitere Verarbeitung weitergegeben werden.

Ihr, Ihr Blutschlauch kann weitergeleitet werden, und dennoch bleibt bei einem Gerätedefekt noch genügend Blut übrig. Als Nächstes werden wir die Spritze, die Blut enthält, auf diese Nadel aufsetzen, die mit einem Schlauchstück verbunden ist, das an dieses Gerät angeschlossen ist. Wir müssen dabei sehr vorsichtig mit dem mikrofluidischen Isolationsgerät umgehen.

Wir müssen sehr vorsichtig sein, um keine Luftblasen in das Gerät einzubringen, da das Gerät sonst fehlerhaft funktionieren würde. Üblicherweise nehmen wir die Spritze, drücken den Kolben herunter und geben die Flüssigkeit auf die obere Oberfläche des Geräts, wobei wir sicherstellen, dass sie vollständig benetzt ist, bevor wir die gesamte Flüssigkeit ausgestoßen haben. Dann halten wir an und entfernen vorsichtig den Spritzenkörper von der Nadel, um im Wesentlichen die Nadelspitze beziehungsweise den Anschlussstecker der Nadel mit dem verbleibenden Puffer in der Spritze zu füllen.

Wir entsorgen das. Danach nehmen wir unsere Spritze mit Blut und führen sie in dieses Luer-Anschlussstück ein. Dabei achten wir darauf, das Blut nicht zu verschütten und keine Luftblasen einzubringen.

Es empfiehlt sich, eine Pinzette zu verwenden, um den Spritzenkörper und den Schlauch zu halten, falls Blut austritt. Sobald die Spritze mit dem Schlauchanschluss oder der Nadel verbunden ist, klopfen wir einige Male kräftig darauf, um eventuelle Luftblasen an der Verbindungsstelle zu entfernen. Anschließend wird die Spritze in die Spritzenpumpe eingesetzt und mit der Verriegelungsschraube befestigt.

Die Spritzenpumpe wird eingeschaltet und ist bereits auf unsere Strömungsbedingungen voreingestellt. Wir werden dieses Blut mit einer Geschwindigkeit von 30 Mikrolitern pro Minute durch das Gerät leiten. Sobald der Spritzenkörper in die Spritzenpumpe eingelegt ist, drücken wir den Knopf am beweglichen Kolbenarm herunter und schieben ihn nach unten, bis er die Oberseite des Kolbens berührt und die Flüssigkeit durch die Spitze herauszudrücken beginnt.

Es ist eine stumpfe Nadel aus rostfreiem Stahl. Sobald wir wissen, dass das System entlüftet ist, drücken wir „Start“, um den Blutfluss zu beginnen. Um den Fluss zu stoppen, drücken Sie „Stopp“ und nehmen dann ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen oder Fendor-Röhrchen; anschließend ziehen wir vorsichtig den Stecker ab.

Ziehen Sie nur einen Stecker heraus und trennen Sie den Schlauch von einem Anschluss des Geräts. Sobald dieser Schlauch abgetrennt ist, werden wir ihn in das 1,5 mil Fendor-Röhrchen einführen. Danach drücken wir „Start“, um den Blutfluss erneut zu beginnen.

Und wenn wir einen Blutstropfen entstehen sehen, stoppen wir die Pumpe und führen sie in den Einlass ein, den wir gerade im Gerät geöffnet haben. Wir betätigen „Start“, um den Blutfluss zu beginnen, und stellen einen Timer auf fünf Minuten. Wir müssen sicherstellen, dass das Blut alle Kammern gleichmäßig füllt und dass sich keine offensichtlichen Luftblasen im Gerät befinden.

Wenn Luftblasen den Durchfluss in eine der Kammern blockieren, können Sie eine Pinzette nehmen und entlang der kleinen Kanäle führen, die zu den Erfassungskammern führen, oder entlang der kleinen Kanäle, die aus den Erfassungskammern austreten. Das Gerät füllt sich gut, daher drücken Sie nach fünf Minuten die Stopp-Taste an der Spritzenpumpe, um den Blutfluss zu beenden, lösen die Klemme der Spritze und nehmen sie aus der Halterung der Spritzenpumpe heraus. Danach verwenden wir Spritze Nummer drei, die mit nukleasefreier PBS beladen ist. Wir werden – kurz gesagt – erneut sicherstellen, dass die Oberfläche des Geräts gut anliegt, um Luftblasen zu vermeiden, und die Spritze antippen, um sicherzustellen, dass sich eventuelle Luftblasen an der Oberseite des Spritzenkörpers befinden.

Lösen Sie den Arm der Spritzenpumpe und setzen Sie die Drei-Milliliter-Spritze in die Pumpe ein. Ziehen Sie sie fest und drücken Sie dann den Kolben herunter, bis er mit dem Kolben der Spritze in Kontakt steht. Wir starten den Vorgang und warten, bis die Flüssigkeit das Gerät entlüftet, und beobachten, bis ein Tropfen an der Spitze der Edelstahlnadel sichtbar wird.

Wenn Sie einen Tropfen bilden sehen, stoppen Sie die Pumpe. Wir werden das Blut und die Edelstahlnadel, die das Blut enthält, entfernen. Anschließend werden wir den Waschpuffer einsetzen und „Start“ drücken.

Und wir lassen dies fünf Minuten lang laufen. Sie sollten ein sauberes Tuch nehmen und jegliche kleine Menge Blut abwischen, die sich am Einlass oder Auslass befinden könnte. Nach fünfminütigem Durchlaufen des Waschpuffers durch das Gerät sollte das Gerät vollständig von Blut befreit sein, was daran erkennbar ist, dass kein rotes Blut mehr im Gerät sichtbar ist und dieses klar aussieht. Wir werden also nach den fünf Minuten das Durchlaufen des Waschpuffers stoppen.

Und erneut nehmen wir die Spritze von der Spritzenpumpe. Wir verschließen das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen direkt am flexiblen Abgabeschlauch. Anschließend heben wir das Röhrchen, das Mikrozentrifugenröhrchen, vorsichtig an und ziehen das Abfallschlauchstück aus dem Gerät heraus.

Wir werden dies in einen Bioabfallbehälter entsorgen. Im Kit befindet sich ein neues Abflussrohr, das eigentlich aus Teflon besteht. Es hat erneut eine Spitze aus rostfreiem Stahl.

Wir werden die alte Auslassschlauchleitung durch diese neue Auslassschlauchleitung ersetzen. Wir nehmen diese Auslassschlauchleitung und versuchen, sie in eine U- oder V-Form zu biegen. Außerdem gehört zu dem Kit eine Kaya-Shredder-Säule, die DNA schert und im Wesentlichen Ihre Zelllyse homogenisiert.

Wir öffnen nun die violette Kappe der Shredder-Säule und führen das Abflussrohr in die Kay-Shredder-Säule ein. Aus dem Kit entnehmen wir die Spritze Nummer zwei, die für RLT verwendet wird. Es handelt sich um eine standardmäßige BD-Einmilspritze mit stumpfem 22-Gauge-Edelstahlende.

Wir werden damit 350 Mikroliter Standard-RLT von Kyogen in das Gerät einspritzen. Da das Gerät ein Totvolumen von etwa 50 Mikrolitern aufweist, möchten wir das RLT injizieren und hinter dem RLT einen Lufttropfen nachspritzen, um das Totvolumen des Geräts in die Chi-Shredder-Säule abzugeben. Dazu entnehmen wir mit unserer Spritze zunächst 350 Mikroliter Luft und anschließend 350 Mikroliter (bzw. 0,35 Milliliter) RLT, sodass sich das RLT nun am unteren Ende der Spritze befindet.

Widerstehen Sie der Versuchung, die Spritze umzudrehen und die Luft einzuspritzen. Die Luft ist notwendig, um sicherzustellen, dass wir das gesamte RLT in unsere Kay-Shredder-Säule überführen. Wir werden nun den Schlauch vom Waschpuffer abziehen.

Wir werden unsere Spritze mit dem RLT einführen und das RLT langsam über einen Zeitraum von etwa 30 Sekunden in das Gerät injizieren, wobei sichergestellt werden muss, dass das Auslassrohr sein Abfallprodukt in die Chi-Shredder-Säule abgibt. Sobald Luft in das Gerät injiziert wird, drücken Sie den Kolben herunter und warten, bis die gesamte Flüssigkeit in die Kay-Shredder-Säule abgegeben wurde. Wir verschließen die Kay-Shredder-Säule und zentrifugieren sie zwei Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei ausgewogener Belastung mit 15.000 U/min oder der maximalen U/min eines Tischmodells einer Mikrozentrifuge.

Nachdem die Säule zwei Minuten lang zentrifugiert wurde, entnehmen wir die Probe, die sich nun in RLT befindet, und geben sie in eines der beigefügten Kryoröhrchen mit lila Verschlusskappe. Wenn Sie mit einer klinischen Probe arbeiten, beschriften Sie diese Kryoröhrchen zu Beginn des Experiments. Hier ist das Lysat im Kryoröhrchen.

Dieses Kryo-Gefäß wird sofort in einen minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank gegeben und zur späteren Versendung oder RNA-Extraktion gelagert. Dies ist somit ein alternatives Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen. Anstatt die Zellen mit RLT-Puffer zu lysieren, werden wir sie mit einer standardmäßigen histologischen Färbung anfärben.

Ein Farbstoff. Wir nehmen das versiegelte Gerät aus der Tüte, wickeln es erneut aus, notieren die Chargennummer des Geräts und stellen die Petrischale in den Petrischalenhalter.

Wir nehmen die Ein-Milliliter-Spritze aus ihrer Verpackung, Spritze Nummer eins, laden sie mit 700 Mikrolitern Blut auf und injizieren die Hälfte davon, 350 Mikroliter, in ein Eppendorf-Röhrchen mit DPH. Dieses stellen wir beiseite. Dann nehmen wir die Spritze Nummer vier, die den Schlauch enthält, den wir zum Einspritzen verwenden werden, und injizieren das Blut in das Gerät.

Halten Sie die Basis der Nadel vom Ende des Schlauchs aus chemischer Sicht fest. Entfernen Sie den Spritzenkörper und füllen Sie die Luer-Aufnahme. Der Adapter würde die Spritze puffern und entsorgen.

Wir werden die blutgefüllte Spritze unter Verwendung des Chemiewischs, um eventuelle Überschwemmungen aufzufangen, in die Nadel einführen. Wir klopfen leicht auf die Spritze, um Luftblasen an der Verbindung zwischen Nadel und Spritzenkörper zu entfernen. Danach laden wir die Spritze in die Spritzenpumpe und führen das Vorlaufen der Tubing durch, indem wir den beweglichen Arm der Spritzenpumpe nach unten drücken.

Wir trennen das Schlauchsystem von einem der Ausgänge des Geräts, dem Erfassungsgerät, und führen es in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen ein. Anschließend beginnen wir mit dem Durchfluss von Blut, indem wir am Spritzenpumpen-Gerät die Taste „Run“ drücken. Wir warten, bis sich ein Blutstropfen an der Edelstahlnadel bildet.

Sobald sich der Tropfen gebildet hat, drücken Sie auf „Stop“, tupfen dieses Blut ab, führen es in das Gerät ein und drücken „Start“. Nun stellen wir einen Timer auf fünf Minuten. Gut, nachdem das Probenmaterial fünf Minuten lang durch das Gerät geflossen ist, drücken Sie am Spritzenpumpen-Controller „Stop“ und entriegeln Sie die Spritze.

Und wir werden diese Spritze durch die Drei-Milliliter-Spritze ersetzen, die unseren Waschpuffer enthält, also einfach 1x PBS. Auch hier müssen wir sicherstellen, dass die Oberseite des Geräts verschlossen ist, und dann entfernen wir die Nadelspitze, die Blut oder Laufpuffer enthält. Beginnen Sie mit dem Vorbefüllen des Geräts.

Wir erzeugen Tropfen, geben sie in das Gerät, starten den Vorgang und tupfen jegliches Blut an der Einlass- oder Auslassleitung ab. Danach lassen wir den Fluss fünf Minuten lang nach dem Waschschritt weiterlaufen. Erneut stoppen wir die Spritzenpumpe und entfernen die Spritze aus dem Pumpenhalter. Um eine Standard-GIM-Imprägnierung durchzuführen, fixieren wir zuerst die Zellen und dehydrieren sie anschließend mit 100 % Methanol.

Wir haben also eine Spritze, eine Dreimilliliterspritze, die vorab mit Methanol beladen ist. Wiederum werden wir die Spritze spülen, um sicherzustellen, dass Methanol fließt, die Spritzenpumpe anhalten, sie in das Gerät einführen und „Start“ drücken. Wir werden sie in dieser Methanol-Lösung zwei bis vier Minuten lang fixieren.

Nach zwei bis vier Minuten Fixierung mit Methanol stoppen wir die Pumpe, entnehmen die Spritze mit Methanol und befüllen nun eine Spritze – eine Dreimilliliterspritze – mit EEM-Sustain-Standard (EEM Sustain von Sigma), der im Verhältnis 1:5 in entionisiertem Wasser verdünnt wurde. Nach der Verdünnung laden wir die Lösung in die Spritze und befestigen am Ende der Spritze einen 0,8-Mikron-Filter, um Partikel herauszufiltern, die sonst das Gerät verstopfen könnten. Färben Sie fünf bis zehn Minuten lang.

Und dann spülen wir mit entionisiertem Wasser. Nach fünf bis zehn Minuten Färbung stoppen wir die Spritzenpumpe und tauschen die Spritze mit dem Färbe-Puffer gegen eine Spritze mit entionisiertem Wasser aus. Im Wesentlichen spülen wir so lange, bis die blaue Farbe des SAI aus dem Gerät entfernt wurde. Sobald das überschüssige Gim Sustain aus dem Gerät ausgespült ist, stoppen wir die Waschlösung.

Als Nächstes entfernen wir die Wasserspritze vom Einlass. Danach nehmen wir das Auslassrohr des Geräts und greifen das Rohrende mit der Pinzette.

Dies ist ein flexibles Tigon-Schlauchmaterial, das wir wieder in den Eingang des Geräts einführen werden. Dadurch wird das Gerät abgedichtet und die Zellen bleiben hydratisiert und ihre Morphologie bleibt intakt. Nun wird mein Kollege, Dr. John Hong Chang, ein alternatives Protokoll zur Isolierung von CD4-positiven Lymphozyten demonstrieren, gefolgt von einer immunfluoreszenten Färbung direkt innerhalb des mikrofluidischen Geräts.

Mein Name ist Shong Hong, und heute werde ich Ihnen die Zellfärbung in einem mikrofluidischen Gerät demonstrieren. In diesem Stadium kann ich Ihnen bereits zeigen, wie man ein mikrofluidisches Immunoaffinitäts-Isolationsgerät verwendet, um gezielt Blutzellen aus unverdünntem Vollblut zu isolieren. Für seinen Zweck möchte er die Zellen lysieren und den Proteingehalt sowie den DNA-Gehalt aus diesen isolierten Zellen gewinnen. Für meine Forschung hingegen interessiere ich mich dafür, die Zellen zu erhalten und anschließend die Zellzahl zu bestimmen, beispielsweise die CD4-Zellzahl aus Vollblut zu ermitteln und diese als Indikator für diagnostische Zwecke zu verwenden.

Die verwendete Vorrichtung ist der Vorrichtung von Ken also sehr ähnlich. Sie besteht aus einer geraden Kammer aus PDMS. Die Geometrie unterscheidet sich leicht, sodass die Betriebsparameter leicht variieren, während im Allgemeinen der gesamte Betriebsablauf sehr ähnlich ist.

Daher werde ich alle Schritte zur Zellaufnahme und zum Spülen überspringen und direkt zum Färbungsschritt bei der Zellzählung übergehen. Hier habe ich ein Gerät, in dem bereits halbwegs Zellen aus Vollblut erfasst wurden, und das Gerät wurde bereits mit PBS gespült. Die ausströmenden Zellen wurden bereits aus dem Gerät ausgewaschen, und ich habe im Voraus eine Antikörpermischung vorbereitet, die speziell dazu dient, die in das Gerät isolierten Zellen zu markieren.

Die hier verwendete Antikörperkonzentration wurde daher für die Färbung von Zellen mit sehr hoher Fluoreszenzintensität unter dem Fluoreszenzmikroskop optimiert. Das Verfahren ist recht einfach. Wir laden die mit der Antikörperlösung gefüllte Spritze auf die Spritzenpumpe und stellen sicher, dass die Flussrate auf die erforderlichen Parameter eingestellt ist.

Dann starten wir die Spritzenpumpe, beobachten das Ende der Schlauchleitung und stellen sicher, dass bereits Lösung austritt, sodass sich keine Blasen mehr in der Leitung befinden. Anschließend können wir die Leitung mit dem mikrofluidischen Gerät verbinden, in dem die Zellen eingefangen sind. Nun fließt also das Antikörperreagenz in das Gerät, um die darin isolierten Zellen zu markieren. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt hier fünf Mikroliter pro Minute, je nach Geometrie des Geräts können jedoch andere Durchflussparameter für Ihren Anwendungszweck geeigneter sein.

Und wir leiten die Antikörperlösung fünf Minuten lang durch den Kanal, was ausreicht, um ein Volumen zu erreichen, das die gesamte Flüssigkeit im Mikrokanal ersetzt. Nach der Antikörperinjektion stoppen wir also den Durchfluss. Wir führen den Antikörper mit fünf Mikroliter pro Minute fünf Minuten lang ein, um die gesamte Flüssigkeit im Mikrokanal auszutauschen.

Anschließend wird der Durchfluss gestoppt und das Gerät 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Schritt sollte im Dunkeln erfolgen, damit der Antikörper nicht abgeschwächt wird, während die Zellen mit dem fluoreszierenden Antikörper gefärbt werden. Nach einer typischen Färbungszeit von gewöhnlich 15 bis 30 Minuten wird einfach der Schlauch vom Gerät abgetrennt und die Antikörperspritze durch eine Pufferspritze ersetzt, um nicht gebundene Antikörper aus dem Gerät auszuwaschen.

Die Waschlösung enthält hier 1 % BSA in PBS-Lösung. BSA dient dazu, eine unspezifische Bindung des Antikörpers an die Oberfläche zu blockieren, und genau dies werden wir ebenfalls tun. Zunächst stellen wir die Flussrate an der Spritzenpumpe ein, um sicherzustellen, dass die gewünschte Flussrate eingehalten wird. Danach starten wir die Spritzenpumpe und überprüfen, ob tatsächlich Flüssigkeit aus der Schlauchleitung austritt, bevor wir sie mit dem Gerät verbinden.

Der Zweck dabei ist, dass keine Blasen in der Schlauchleitung verbleiben. So gelangen beim Injizieren keine Blasen in unser Gerät. Daher schließen wir einfach die Schlauchleitung an das Gerät an und lassen den Durchfluss weitere fünf Minuten lang andauern, um die gesamte Waschflüssigkeit sowie alle nicht gebundenen Antikörper aus dem Gerät zu entfernen.

Nach dem Waschschritt fixieren wir die Zellen mit 1 % PFA. Der Zweck dieser Maßnahme besteht darin, das Gerät für einige Wochen lagerfähig zu machen, falls die Bildgebung nicht sofort durchgeführt werden kann. Das Verfahren ist daher recht einfach.

Es ist ähnlich wie zuvor. Wir laden die Spritze in die Pumpe ein, stellen die gewünschte Flussrate ein und starten dann die Spritzenpumpe. Anschließend verbinden wir das Schlauchsystem mit unserem Gerät, um die Paraform-IDE-Lösung, also das Fixans, in das Gerät einzuleiten, um die Zellen zu fixieren. Auch diesmal lassen wir die Lösung etwa fünf Minuten lang fließen.

So ersetzt PFA die gesamte Pufferlösung im Gerät, um alle Zellen im Gerät zu fixieren. Nach dem PFA-Fixierungsschritt wird daher einfach die PFA-Spritze entfernt, und das Gerät ist nun bereit für die Bildgebung. In einigen Fällen wünschen Forscher eine Kernfärbung, um sie mit der Färbung ihrer Zelloberflächenmarker überlagern zu können.

Dazu führen wir am Ende eine Kernfärbung mit DPI durch. Wir laden also die DPI-Spritze auf, schalten die Spritzenpumpe ein und leiten DPI in unser Gerät. Nun werden die Kerne in diesen Zellen angefärbt, um die Position der Zellen sichtbar zu machen.

Und dieses DPI-Färbungsbild kann anschließend mit der Oberflächenmarkierung überlagert werden, um die Position der Zellen darzustellen. Am Ende der DPI-Färbung müssen wir daher erneut das nicht gebundene DPI mit Pufferlösung abwaschen. Auch hier verwenden wir PBS mit 1 % BSA, um das nicht gebundene DPI abzuwaschen.

Und der Vorgang ähnelt dem, was wir zuvor bereits durchgeführt haben. Wir setzen einfach die Puffer-Spritze in unser Gerät ein und lassen Puffer durch das Gerät fließen, um nicht gebundenes Dap abzuwaschen. Das ist somit die gesamte Prozedur zur Färbung von Zellen in einem Mikrofluidik-Gerät.

Und nach Abschluss sämtlicher Färbeprozeduren sind die Geräte bereit für die Bildgebung. Da wir mit PFA fixiert haben, können die Geräte zudem einige Wochen lang gelagert werden, falls die Bildaufnahme nicht unverzüglich durchgeführt werden kann.