Visualizing Proteine und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition
22. Dezember 2011
Visualizing Protein-Proben von negativen Fleck-Elektronenmikroskopie (EM) hat sich zu einem beliebten Strukturanalyse Methode. Es ist für die quantitative Struktur-Analyse nützlich, wie zum Beispiel die Berechnung einer 3D-Rekonstruktion der Moleküle untersucht, und auch für qualitative Prüfung der Qualität von Protein-Präparationen. In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Vorbereitung der EM-Gitter, Färbung der Probe und die Visualisierung der Probe in einem Elektronenmikroskop. Unerfahrene Benutzer können diese Protokolle einfach zu folgen und zu nutzen Negativfärbung EM als Routine-Test, zusätzlich zu anderen biochemischen Assays für die Bewertung ihrer Protein-Proben.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gereinigte Proteinproben mittels Elektronenmikroskopie mit negativer Kontrastfärbung sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Elektronenmikroskopie-Gitter vorbereitet werden, die die Probe tragen sollen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Herstellung der Lösung für die negative Kontrastfärbung.
Anschließend wird die Probe auf das Elektronenmikroskopie-Gitter aufgebracht und negativ gefärbt. Abschließend wird das EM-Gitter in ein Elektronenmikroskop eingebracht, und Bilder werden unter geeigneten optischen Bedingungen aufgenommen. Konventionelle Hellfeld- und DEM-Aufnahmen weisen einen hohen Kontrast und scharfe Details auf und zeigen einzelne Makromoleküle, die über einen strukturlosen Hintergrund verstreut sind.
Die Negativkontrast-Elektronenmikroskopie ist eine einfache Methode, um Ihr Lieblingsprotein sichtbar zu machen. Sie kann als routinemäßiger Test verwendet werden, um Ihr gereinigtes Protein entweder für strukturelle Analysen oder andere biochemische und biophysikalische Untersuchungen zu überprüfen. Hier zeigen wir, wie man eine negativ kontrastierte Probe für die Elektronenmikroskopie vorbereitet.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da einige Schritte schwer allein anhand von Textbeschreibungen und Abbildungen zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, mit einer Glaspipette einen einzelnen Tropfen Collodium auf die Wasseroberfläche in einem großen Becher mit Wasser aufzutragen. Während sich das Collodium ausbreitet, kann es Staub von der Wasseroberfläche einfangen.
Entfernen und ersetzen Sie einen staubigen Collodion-Kunststofffilm durch einen weiteren Tropfen. Legen Sie anschließend zwischen 50 und 100 EM-Gitter einzeln mit der glänzenden Seite nach unten auf den schwimmenden Kunststofffilm. Wählen Sie 400er-Maschen-Gitter für die routinemäßige Negativfärbung und 200er-Maschen-Gitter.
Zum Sammeln von Kipp-Paar-Bildern. Wählen Sie ein Stück Papier mit geringer Saugfähigkeit und ohne Falten, das etwas größer ist als der Bereich der Gitter. Legen Sie das Papier auf die Gitter und warten Sie, bis das Papier vollständig durchnässt ist.
Das Papier sollte Wasser nicht zu schnell absorbieren. Wir verwenden Papier aus einem preiswerten Notizblock. Die Gitter liegen nun zwischen der Kunststofffolie und dem Papier.
Verwenden Sie eine Pinzette, um das Papier in eine Petrischale zu legen und langsam an der Luft trocknen zu lassen. Vermeiden Sie schnellere Trocknungsmethoden, da diese zu Falten führen können. Die Kohlenstoffbeschichtungsanlage, die in unserem Labor verwendet wird, ist eine Creston 2 0 8 C Hochvakuum-Turbo-Kohlenstoffbeschichtungsanlage.
Ausgestattet mit einem Creston-Dickenmessgerät für Filme. Das Messgerät nutzt eine Quarzwaage, die empfindlich gegenüber Kohlenstoffablagerungen ist. Das hier beschriebene Protokoll erfordert dieses Gerät jedoch nicht. Beginnen Sie damit, die Kohlenstoffstäbe in einer Kohlenstoffbeschichtungsmaschine zu spitzen und zu laden.
Nächste Beschichtung: Eine Objektträger mit Vakuumfett beschichten, wobei die Hälfte des mattierten Bereichs unbeschichtet bleibt. Nach der Kohlenstoffbeschichtung werden die mit Fett behandelten Bereiche des Objektträgers verwendet, um die Dicke der Kohlenstoffschicht abzuschätzen. Legen Sie das Papier mit den Gittern auf den Halter unter der Vakuumglocke der Kohlenstoffbeschichtungsanlage. Positionieren Sie den beschmierten Glasobjektträger.
Schieben Sie neben die Gitter. Pumpen Sie die Vakuumkammer auf mindestens 10 Mikrotorr auf, da sonst Funkenbildung viele große Partikel im Gitter erzeugt. Erhöhen Sie nun den Strom sehr langsam.
Die scharfe Spitze der Kohlenstoffstange wird äußerst hell leuchten. Beobachten Sie sie nicht mit bloßem Auge, sobald die Beschichtung beginnt. Der Objektträger verfärbt sich dunkelgrau, während sich die Kohlenstoffschicht aufbaut. Unterbrechen Sie den Strom bei der gewünschten Kohlenstoffschichtdicke und berücksichtigen Sie dabei die Durchsichtigkeit des Glasglockengehäuses. Sobald die Dunkelheit des Objektträgers auf die Dicke der Kohlenstoffschicht kalibriert ist, ist diese Methode genauso genau wie der kostspieligere Schichtdickenmonitor.
Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, entlüften Sie die Vakuumkammer und nehmen Sie die beschichteten Gitter für die spätere Verwendung heraus. Die dünne Kunststoffschicht beeinträchtigt nicht die Qualität des negativ gefärbten Bildes, kann jedoch durch Einweichen der Gitter in Chloroform über mehrere Stunden vor dem Fortfahren entfernt werden. Stellen Sie eine frische Uranylformiat-Lösung her oder verwenden Sie eine Lösung, die weniger als zwei Wochen im Dunkeln aufbewahrt wurde.
Eine gute, frische Lösung hat eine gelbe Farbe, einen pH-Wert von etwa vier und läuft sehr klar ohne Niederschläge. Beginnen Sie damit, ein handelsübliches System zum Leuchten zu bringen. Entladen Sie die mit Kohlenstoff beschichteten Gitter.
Als Nächstes zwei 20-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser und zwei 25-Mikroliter-Tropfen frische Urinalformat-Lösung auf ein Stück Perfil geben. Mit einer reversen kapillaren Pinzette eine entladene, mit Kohlenstoff beschichtete Netzseite nach oben haltend festhalten. Wichtig ist, dass diese Pinzette keine Flüssigkeit von den Netzen absaugt.
Tragen Sie nun zwei Mikroliter der Proteinstichprobe auf das Raster auf und warten Sie, bis die Proteine in das Raster eingedrungen sind. Dies dauert typischerweise 30 Sekunden, jedoch benötigen sehr verdünnte Proben mehr Zeit, was die Pufferkonzentrationen beeinflussen kann. Danach entfernen Sie die Proteinstichprobe mit Filterpapier ab.
Anschließend den Träger zweimal waschen, indem man seine Oberfläche kurz mit einem Wassertropfen in Berührung bringt und innerhalb weniger Sekunden trocken tupft. Nachdem das Wasser den Träger kurz berührt hat, diesen mit einem Tropfen Färbemittel in Kontakt bringen und schnell trocken tupfen. Mit derselben Technik den Träger anschließend 20 Sekunden lang mit einem zweiten Tropfen Färbemittel in Berührung halten.
Trocknen Sie das Raster abschließend an der Bankabzugshaube luftdurchlässig oder vorzugsweise im Vakuum vor der EM-Session. Überprüfen Sie die Ausrichtung des EM-Mikroskops, indem Sie eine optimierte Ausrichtungsdatei laden, sofern verfügbar; dies sollte es nahezu perfekt ausrichten. Laden Sie nun das EM-Raster auf einen Standardprobenträger mit Einzelkippvorrichtung. Danach setzen Sie den Träger in die Probehalterung ein.
Warten Sie dann, bis der Pumpzyklus abgeschlossen ist, und setzen Sie den Halter in die Säule ein. Suchen Sie nun manuell nach einer Probenstelle mit guter Färbung, indem Sie entweder die Methode des minimalen Kontrasts verwenden oder eine CC, D-Kamera nutzen und den Live-Vierer berechnen.
Ihr Leistungsspektrum. Stellen Sie dann den Tiefenfokus nach Bedarf ein, üblicherweise auf negative 1,5 Mikrometer. Die Färbekonzentration kann über das Gitter variieren, daher suchen Sie nach Proteinen mit weißem Kontrast.
Vermeiden Sie Bereiche mit ungleichmäßiger Färbung oder positiver Färbung, bei denen der Protein-Kontrast schwarz wird. Unter Verwendung des beschriebenen Ansatzes zur Herstellung von Gittern und zur Visualisierung negativ gefärbter Proben wurden mehrere bekannte Proteine zu Demonstrationszwecken abgebildet.
Achten Sie auf ihre Detailgenauigkeit und den scharfen Kontrast. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man Proben negativ gefärbter Makromoleküle zur Beobachtung im Elektronenmikroskop herstellt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa vier Stunden durchgeführt werden.
Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die 3D-Rekonstruktion durchgeführt werden, um molekulare Strukturen besser zu verstehen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung gereinigter Proteinstichproben mittels negativer Kontrastierung in der Elektronenmikroskopie (EM) vor. Die Methode ist für Anfänger geeignet und dient als Routineverfahren zur strukturellen Analyse von Proteinen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Strukturbiologie
- Elektronenmikroskopie
- Proteinanlyse
Hintergrund
- Die Negativkontrast-EM ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung von Proteinen.
- Sie ermöglicht sowohl qualitative als auch quantitative strukturelle Analysen.
- Protokolle zur Probenvorbereitung und Visualisierung sind für eine erfolgreiche Anwendung unerlässlich.
- Diese Methode kann das Verständnis von Proteinstrukturen verbessern.
Zweck der Studie
- Eine umfassende Anleitung zur Herstellung von EM-Gittern und zur Färbung von Proben bereitstellen.
- Die Visualisierung von Proteinen mittels Negativkontrast-EM demonstrieren.
- Die routinemäßige Anwendung dieser Methode in der Proteinanalyse erleichtern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Elektronenmikroskopie-Gittern.
- Auftragung der Negativkontrastlösung auf Proteinproben.
- Sichtbarmachung der Proben im Elektronenmikroskop.
- Aufnahme von Bildern unter optimalen Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Es wurden Bilder von Proteinen mit hohem Kontrast erhalten.
- Es wurden detaillierte Protokolle erfolgreich demonstriert.
- Visuelle Hilfsmittel verbesserten das Verständnis komplexer Schritte.
- Die Ergebnisse stützen die Verwendung der Negativkontrast-EM für die routinemäßige Proteinanalyse.
Schlussfolgerungen
- Die Negativkontrast-EM ist eine effektive Methode zur Proteinvisualisierung.
- Die bereitgestellten Protokolle können leicht von unerfahrenen Anwendern befolgt werden.
- Diese Technik kann andere biochemische Assays ergänzen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Negativkontrast-Elektronenmikroskopie (EM) ermöglicht eine schnelle, hochkontrastreiche Visualisierung gereinigter Proteine und makromolekularer Komplexe und erlaubt so eine Beurteilung der Probengüte und des Assemblierungszustands in einem frühen Stadium. Diese Methode unterstützt entscheidende Go/No-Go-Entscheidungen in Entdeckungsprozessen, indem sie die Homogenität der Probe und die Bildung von Komplexen bestätigt, bevor aufwändige nachgeschaltete Untersuchungen durchgeführt werden. Aufgrund ihrer Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit stellt sie ein grundlegendes Werkzeug für Strukturbiologie-Teams in der biopharmazeutischen Forschung dar.&D.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung&D
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung von Protein-Komplexen zur Bestätigung der Assemblierung und Integrität.
- Ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Probenhomogenität und verringert damit Unklarheiten bei der Zielvalidierung.
- Erleichtert die frühzeitige Erkennung von Aggregation oder Degradation und reduziert Risiken in nachgeschalteten Arbeitsabläufen.
- Liefert visuelle Belege zur Unterstützung mechanistischer Hypothesen bei der Zielstrukturauswahl.
Screening und Assay-Entwicklung
- Überprüft die Qualität von Proteinpräparationen vor der Hochdurchsatz-Screening oder der Assay-Entwicklung.
- Gewährleistet die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Probeneingaben für quantitative Assays.
- Ermöglicht die skalierbare Herstellung validierter EM-Gitter für die wiederholte Verwendung in Screening-Kampagnen.
- Unterstützt die zuverlässige Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf die Proteinstruktur oder -assemblierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Bestätigt die strukturelle Integrität von therapeutischen Kandidaten vor präklinischen Studien.
- Verknüpft visuelle Daten mit biochemischen und biophysikalischen Assays, um eine translationale Kohärenz sicherzustellen.
- Verringert das Risiko, strukturell beeinträchtigte Kandidaten in präklinische Modelle zu überführen.
- Liefert grundlegende Daten für anschließende 3D-Rekonstruktionen und mechanistische Untersuchungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Negativkontrast-EM nimmt eine Schnittstelle zwischen Proteinreinigung sowie struktureller oder funktioneller Charakterisierung ein und verbindet damit die frühe Entdeckungsforschung mit der präklinischen Forschung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Visualisierung von Protein-Komplexen und -Assemblierungen.
- Screening: Bestätigt die Probenqualität und Reproduzierbarkeit für nachgeschaltete Assays.
- Analytik: Liefert hochkontrastreiche Bilder zur quantitativen Beurteilung der Probeneinheitlichkeit und Aggregation.
- Translationale Forschung: Stellt die strukturelle Integrität von Kandidaten sicher, die in die präklinische Validierung eingehen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten, routinemäßigen Assay, der auf verschiedene Proteinziele und Projekte anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich Probenqualität und Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht schnelle, reproduzierbare und skalierbare Visualisierungsworkflows.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und verringert biologische Risiken in späteren Phasen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung strukturell validierter Kandidaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie und Bedienung des Instruments.
- Benötigt Zugang zu Elektronenmikroskopie-Ausstattung und Färbelösungen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg für reproduzierbare Probenvorbereitung und Bildgebung voraus.
- Anpassungsfähig an eine breite Palette von Proteingrößen und Komplextypen.
- Auf die Oberflächenvisualisierung beschränkt; nicht geeignet für die Analyse interner Strukturen mit hoher Auflösung.
