Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine direkte Visualisierung von mitochondrialen respiratorischen Enzymdefiziten in frisch gefrorenen Gewebeschnitten zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst Kryostatschnitte aus dem betreffenden Organ gewonnen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Durchführung der COX-Histochemie, der die SDH-Histochemie folgt.

Schließlich werden die Gewebeschnitte dehydriert, präpariert und mit Deckgläsern versehen. Letztendlich können die Ergebnisse die Menge an mitochondrialer Dysfunktion anhand der Intensität der blauen Zellfärbung zeigen. Hallo. Heute werden wir über die doppelte Histochemische Färbung nach Cox-SCH sprechen.

Und während diese Methode zur Untersuchung von Mitochondrienerkrankungen angewendet werden kann, liefert sie auch Erkenntnisse über den Alterungsprozess und altersbedingte Störungen. Entfernen Sie nach der Tötung eines Versuchstieres gemäß ethischer Genehmigung das Gehirn und frieren Sie es rasch auf Trockeneis ein. Das gefrorene Gewebe kann, in Aluminiumfolie verpackt, bis zur Schnittführung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Bereiten Sie das Gewebe für das Kryoschneiden vor, indem Sie das Gehirn auf einen Kryostat-Block legen und mit Einbettungsmittel umgeben. Stellen Sie den Block schnell in den Kryostaten und schneiden Sie 14 µm dicke Schnitte bei minus 21 °C. Tauen Sie die Schnitte mithilfe eines Heizblocks auf Objektträger auf und lassen Sie die Objektträger anschließend eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocknen.

Legen Sie die Objektträger in eine Färbe-Kammer mit feuchten Papierstreifen. Da die Reaktionszeiten bei diesem Assay wichtig sind, wird empfohlen, maximal 10 Objektträger pro Experiment unter einem Abzug zu bearbeiten. Bereiten Sie die Inkubationslösung vor, die DAB und Cytochrom C in PBS enthält, und wirbeln Sie sie mit einem Vortex-Mixer.

Geben Sie schnell zwei Mikrogramm bovines CDE zum Medium hinzu und mischen Sie gründlich durch Vortexen. Um alle noch unter dem Abzug arbeitenden CDE-Körnchen aufzulösen, geben Sie 150 bis 200 Mikroliter Inkubationsmedium auf jeden Objektträger und verteilen Sie es mit der Pipettenspitze gleichmäßig auf alle Abschnitte. Inkubieren Sie die Objektträger 40 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach 40 Minuten das Inkubationsmedium von den Objektträgern entfernen. Die Objektträger viermal jeweils 10 Minuten lang mit PBS waschen. Nach dem Waschen der Objektträger diese wieder in die Objektträgerfärbekammer mit feuchten Papierschlitzen unter einem Abzug zurückbringen.

Bereiten Sie die NBT-Lösung in PBS vor und achten Sie darauf, das PMS vor Licht zu schützen. Wirbeln Sie die Lösung schnell um und geben Sie 150 bis 200 Mikroliter der NBT-Lösung auf jeden Objektträger, wobei Sie die Pipettenspitze verwenden, um die Lösung gleichmäßig auf allen Schnitten zu verteilen. Inkubieren Sie die Objektträger 40 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach 40 Minuten entfernen Sie die überschüssige Lösung von den Objektträgern. Waschen Sie die Objektträger viermal in PBS, jeweils 10 Minuten lang.

Trocknen Sie die Objektträger nacheinander in den folgenden aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol jeweils zwei Minuten lang. 70 %, 70 %, 95 %, 95 % und 99,5 %. Schließlich lassen Sie die Objektträger weitere 10 Minuten in einem zusätzlichen Schritt mit 99,5 % Ethanol. Legen Sie die Objektträger 10 Minuten in Xylol, montieren Sie sie mit LAN und setzen Sie Deckgläser auf.

Lassen Sie die Objektträger hier über Nacht oder mindestens ein bis zwei Stunden in einem belüfteten Bereich trocknen. Hirnschnitte von Wildtyp- und vorzeitig alternden MT.DNA-Mutator-Mäusen wurden nacheinander für die Aktivitäten von COX und SDH markiert.

Normale Cox-Aktivität, gekennzeichnet durch braune Färbung, ist im Hippocampus von Wildtyp-Mäusen zu beobachten. Cox-Mangel, angezeigt durch blaue Färbung, zeigte sich im Hippocampus von mtDNA-Mutator-Mäusen im Alter von 12 und 46 Wochen. Bei den M-T-D-N-A-Mutator-Mäusen war bis zum Alter von 46 Wochen eine weitere Abnahme der Cox-Aktivität festzustellen, was auf eine weit verbreitete Verschlechterung der Atmungskettendysfunktion hindeutet.

Zu kurze Inkubationszeiten von 10 und 25 Minuten führten zu einer verminderten Ablagerung des braunen DAB-Reaktionsprodukts. Die verkürzten Inkubationszeiten ermöglichten während der SDH-Inkubation die Bildung des blauen Foran-Endprodukts, was irreführenderweise auf das Vorhandensein von Zellen mit COX-Defizienz hindeutete. Das Abdecken der Objektträger während der COX-Inkubation führte ebenfalls zu einer ungenauen Bildung und Ablagerung des DAB-Reaktionsprodukts.

Obwohl die Aktivitäten von Cox und SDH einzeln wie hier gezeigt markiert werden können, hat sich die sequenzielle Markierung als vorteilhaft bei der Lokalisierung von Zellen mit mitochondrialer Dysfunktion erwiesen. Ein Beispiel einer Spezifitätskontrolle für die COX- und SDH-Aktivitäten im Gehirn einer Wildtyp-Maus zeigt eine negative Färbung. Vergessen Sie daher nicht, dass die Arbeit mit den Chemikalien im COX-SDH-Doppelfärbungsprotokoll äußerst gefährlich ist und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Laborbekleidung und einer Maske, Arbeiten unter der Abzugshaube sowie die ordnungsgemäße Entsorgung des Inkubationsmediums bei jeder Durchführung dieses Assays stets beachtet werden müssen.