Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, neuronale Nachkommen direkt und ausschließlich aus pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellen mittels Induktion durch kleine Moleküle zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem Retinsäure zu undifferenzierten Zellen hinzugefügt wird, die unter definierten Bedingungen kultiviert werden. Anschließend wird der Differenzierungsprozess fortgesetzt, indem die Zellen abgelöst und in einer Suspensionskultur weitergezüchtet werden, in der sie schwimmende zelluläre Aggregate bilden, die als Neurosphären bezeichnet werden.

Wenn Neuroblasten in einem neuronalen Differenzierungsmedium die Möglichkeit haben, sich an eine Zellkulturschale anzulagern, entwickeln sie Merkmale ausgereifter Neuronen. Letztendlich können Immunfluoreszenz und Dekonvolutions- oder konfokale Mikroskopie verwendet werden, um die Wirkung einer Behandlung mit Retinsäure auf die Morphologie und die Markerausprägung behandelter humaner embryonaler Stammzellen darzustellen. Bei anderen Verfahren entwickelt nur ein kleiner Teil der Zellen ein neuronales Phänotyp, während unsere Methode eine gut kontrollierte und effiziente Induktion pluripotenter humaner embryonaler Stammzellen ausschließlich in eine neuronale Linie durch die einfache Zugabe von kleinen Molekülen ermöglicht.

Bei der Herstellung von Stammlösungen ist auf einige Schritte besondere Vorsicht geboten. Gehen Sie sorgfältig vor, wenn Matrigel und humanes Laminin langsam von minus 80 Grad Celsius auf vier Grad Celsius über Nacht aufgetaut werden. Lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius und erwärmen Sie es stets vor der Verwendung auf 37 Grad Celsius. Außerdem werden beim Herstellen des humanen ESL-Mediums einige der Zusatzstoffe erst unmittelbar vor Gebrauch zugegeben.

Dazu gehören BFGF, Ascorbinsäure, humanes Insulin, das in A aktiv ist, und Transferrin. Danach die Matrigel- oder humanes Laminin-Arbeitslösung unmittelbar vor der Beschichtung der Platten herstellen. Die Platten nach der Herstellung der mit Gelatine vorgeschichteten Zellkulturplatten bei 37 Grad SIU in 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Die Gelatine kann durch die Matrigel- oder Laminin-Arbeitslösung ersetzt werden. Beschichten Sie diese Platten, indem Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Beginnen Sie damit, humane ES-Zellkolonien fünf bis sieben Tage wachsen zu lassen, und bereiten Sie dann die Teilung vor.

Wählen Sie Kolonien aus, die mehr als 75 % undifferenzierte humane ES-Zellen enthalten; diese sind gewöhnlich leicht trüb mit scharf abgegrenzten Rändern und enthalten aufgehäufte Zellen. Ein Hinweis auf den Beginn der Differenzierung ist typischerweise das Auftreten weißer Kolonien; Kolonien, die überwiegend differenzierte Zellen enthalten, erscheinen gewöhnlich klar. Wählen Sie keine weißen oder klaren Kolonien aus.

Halten Sie die Platten gegen das Licht und umreißen Sie mit einem Stift die leicht opaken Kolonien auf der Unterseite der Platten entlang der Konturen. Nutzen Sie die Kante einer sterilen P2-Pipettenspitze, um die umgebende Fibroblastenschicht von der humanen ES-Zellkolonie zu lösen. Entfernen Sie anschließend die umgebenden Fibroblastenzellen sowie alle differenzierten Anteile der Kolonie.

Aspirieren Sie nun das alte Medium, das die abgelösten differenzierten Zellen enthält. Waschen Sie anschließend in jedem Wells die undifferenzierten Zellen einmal mit humanem EES-Zellmedium ohne BFGF und geben Sie dann drei Milliliter frisches humanes ESL-Medium mit B-F-G-F hinzu, wobei B-F-G-F unmittelbar vor der Anwendung dem frischen Medium zugesetzt wird. Verwenden Sie nun eine sterile P2-Pipettenspitze, um die Kolonien in kleine Stücke zu schneiden und sie von der Platte zu lösen.

Ziehen Sie die abgetrennten Koloniestücke zusammen mit ihrem Medium in ein 50-Milliliter-Kegelrohr. Ziehen Sie zusätzlich ein weiteres Milliliter Medium zur Spülung pro Vertiefung auf.

Die Zellen sind nun bereit für eine weitere Differenzierung unter Verwendung von kleinen Molekülen. Erwärmen Sie frisch beschichtete Platten zunächst auf 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung von den Platten und geben Sie einen vier Milliliter großen Aliquot Medium, der Koloniestücke enthält, in jede Vertiefung. Überführen Sie die Platten anschließend vorsichtig, ohne sie zu schütteln, in einen Inkubator.

Stören Sie die Platten nicht, damit sie ansetzen können. Nach dreitägigem Ansetzen frisches Medium herstellen, das Omicsäure enthält. Danach den größten Teil des alten Mediums entfernen, wobei gerade so viel Medium zurückbleibt, dass die Zellen weiterhin überdeckt sind.

Die Zellen dürfen niemals austrocknen. Geben Sie vier Milliliter frisches humanes ES-Zellmedium mit BFGF und Retinsäure hinzu. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag und lassen Sie die mit Retinsäure behandelten humanen ES-Zellkolonien wachsen.

Nach sieben oder acht Tagen haben die Zellen morphologische Veränderungen zu großen differenzierten Zellen durchlaufen. Danach fortfahren, indem eine Suspensionkultur angelegt wird. Um eine Suspensionkultur zu erstellen, beginnen Sie damit, ESL-Kolonien von Zellen abzulösen, die spontan differenziert und sich zu einer Fibroblastenschicht ausgebreitet haben. Verwenden Sie dazu die oben genannte Technik mit einer sterilen Pipettenspitze und saugen Sie anschließend das alte Medium ab, das freischwimmende, abgelöste Fibroblastenzellen enthält.

Waschen Sie die Zellen einmal mit HESC-Medium und resuspendieren Sie sie in drei Milliliter HESC-Medium. Verwenden Sie nun eine sterile P-2-Pipettenspitze, um die Kolonien in kleine Stücke zu schneiden und sie von der Platte zu lösen.

Ziehen Sie das Medium mit den abgelösten Kolonien in ein einzelnes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter Medium und geben Sie die Abwässerung zum gemeinsamen Pool hinzu. Anschließend portionieren Sie vier Milliliter der gepoolten Zellen in jede Vertiefung einer sechs-Vertiefungs-Platte mit ultra-niedriger Anhaftung und inkubieren Sie vier bis fünf Tage lang; stellen Sie die Platte in einen Inkubator.

Während dieser Zeit bilden sich schwimmende zelluläre Aggregate oder Neuroblasten, wodurch die Neuroblasten zu einem reiferen neuronalen Phänotyp weiterentwickelt werden. Überführen Sie das enthaltende Medium in einen 50-Milliliter-Konischgefäß. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 1.400 U/min fünf Minuten lang.

Aspirieren, wiegen Sie so viel wie möglich des alten Mediums ab und geben Sie eine gleiche Menge frisches NSC-Medium mit VEGF N NT drei und BDNF hinzu. Bringen Sie die Zellen durch Pipettieren in eine Suspension und portionieren Sie dann vier Milliliter der Suspension pro Vertiefung in eine sechs-Vertiefungs-Zellkulturplatte. Überführen Sie die Platten in einen feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Die Neuroblasten heften sich über Nacht an die Kulturschalen für eine 3D-Kultur an Matrigel oder menschliches Laminin in der Neuroblastensuspension an. Und eine 3D-Matrix polymerisiert bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag.

Binnen zwei Wochen erscheinen ausgedehnte Netzwerke aus Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen. Retinsäure ist ausreichend, um menschliche ES-Zellen, die in einem definierten Kultursystem gehalten werden, vom pluripotenten Zustand ausschließlich in ein neuroektodermales Phänotyp zu überführen. Nach der Exposition undifferenzierter menschlicher ES-Zellen gegenüber Retinsäure gingen alle Zellen der Kolonie morphologische Veränderungen ein und entwickelten sich zu großen differenzierten Zellen, die die Expression des mit Pluripotenz assoziierten Markers OCT4 einstellten. Die Zellen begannen zudem, verschiedene mit dem Neuroektoderm assoziierte Marker wie HNK-1a, P2 und TRKC zu exprimieren.

Diese großen differenzierten Zellen teilten sich weiterhin, und die Kolonien vergrößerten sich spontan unter Expression des frühen neuronalen Markers Beta-tubulin-3. Der differenziertere neuronale Marker Map-2 erschien in Bereichen der Kolonien, in denen sich die Zellen angehäuft hatten. Zeitgleich mit dem Auftreten der neuroektodermalen Zellen translozierte der neuronenspezifische Transkriptionsfaktor NER-1, der an der dopaminergen Differenzierung und der Aktivierung des Tyrosin-Hydroxylase-Gens beteiligt ist, in den Zellkern.

Nach der Ablösung bildeten die mit Retinsäure behandelten humanen ES-Zellen in einer Suspensionkultur nach Entfernung von basischem FGF Neuroblasten, und nachdem die Neuroblasten an eine Gewebekulturplatte angeheftet wurden, begannen ausgedehnte Netzwerke aus Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen, typisch für das ZNS, mit einer drastischen Steigerung der Effizienz zu erscheinen und konnten über drei Monate kultiviert werden. Diese aus humanen ES-Zellen abgeleiteten neuronalen Zellen exprimierten Beta-3-Tubulin im Vergleich zur spontanen multiliniearen Differenzierung von Zellen ohne Retinsäurebehandlung und coexprimierten MAP2, sobald beherrscht. Diese Technik kann verwendet werden, um neuronale Vorläuferzellen innerhalb von etwa vier Wochen einheitlich aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen zu erzeugen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann, und Maßnahmen wie die Sicherstellung, dass Zelllinien frei von Krankheitserregern und Mykoplasmen sind, sollten stets getroffen werden, bevor dieses Verfahren durchgeführt wird.