Heterogenität Mapping von Protein Expression in Tumoren mittels quantitativer Immunfluoreszenz

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Expression von Biomarkern in gesamten Gewebeschnitten von menschlichem Krebsgewebe genau zu quantifizieren, um einen numerischen Wert für das Ausmaß der Heterogenität in der Proteinausprägung zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst immunfluoreszenzmarkierte Schnitte von Tumorgewebe mit einem Ganzschnitt-Fluoreszenzscanner erfasst werden. Anschließend werden innerhalb des Tumors Regionen von Interesse zur Auswertung ausgewählt.

Anschließend wird die Expression des Proteins von Interesse in den invasiven Tumorbereichen mithilfe des automatisierten Bildanalysesystems AQUA quantifiziert. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um die Expression von Biomarkern in Krebsgewebe abzubilden, die innerhalb eines Gewebeschnitts häufig sehr heterogen ist. Der Hauptvorteil der Anwendung dieser Techniken gegenüber herkömmlichen Methoden wie der Immunhistochemie mit farblichen und metrischen Visualisierungsreagenzien liegt darin, dass die Immunfluoreszenz quantitativer und empfindlicher ist.

Durch die Kombination dieser analytischen Methoden mit einem vollständigen Schnitt ermöglicht das immunfluoreszenzgestützte Scannen eine detaillierte Kartierung subtiler Variationen in der Biomarker-Expression über Gewebe hinweg. Zum ersten Mal werden diese Verfahren von Mark Gustafson, Direktor der Betriebsabteilung am Histo RX-Labor, demonstriert. Nach dem Schneiden einer Krebsgewebeprobe am Mikrotom und der immunfluoreszenzgestützten Färbung der Probe auf die Expression der gewünschten Biomarker werden bis zu fünf Objektträger mit den gefärbten Schnitten in die Objektträgerkassette des Objektträgerscanners eingelegt.

Danach mithilfe der Schnittstelle in der Scan-Scope-Konsole. Wählen Sie für jeden Objektträger einen Bereich aus, der das gesamte Gewebe auf dem Objektträger umfasst, unabhängig vom Färbemuster oder anderen beobachtbaren Aspekten der Probe. Wählen Sie anschließend mithilfe der Scan-Scope-Konsole zunächst einen Gewebebereich zur Auswertung aus, idealerweise innerhalb des Tumorbereichs des Gewebes, um die beste Darstellung zu gewährleisten.

Verwenden Sie nun die automatische Belichtungsfunktion der Scan-Scope-Konsole, um die Belichtungszeit für jeden Kanal sowie den Bildfokus zu bestimmen. Wählen Sie mit dem blauen Diamanten auf dem Bild der Scan-Scope-Konsole einen zusätzlichen Bereich außerhalb des Gewebes, aber noch innerhalb des Objektträgers unter dem Deckglas, um den Hintergrundbereich festzulegen, in dem die Flat-Field-Korrekturbilder aufgenommen werden. Fügen Sie für jeden Filter Fokuspunkte im Gewebebereich, dargestellt durch gelbe Quadrate, hinzu, um die Bildaufnahme zu optimieren. Falls die Bilder einen hohen Hintergrund oder andere Bildartefakte aufweisen, sollte der Bildbereich verschoben und neue Bilder aufgenommen werden.

Das Gewebe wird anschließend gescannt und die gewonnenen digitalen Objektbildaufnahmen automatisch in die Aperio-Spectrum-Datenbank hochgeladen. Doppelklicken Sie auf das Miniaturbild, damit das Spectrum-Programm die Objektträgeraufnahme aus der Liste der digitalen Objektbildaufnahmen in der Spectrum-Datenbank zur Analyse auswählt. Anschließend markieren Sie mithilfe des zugehörigen mit H und D annotierten Bildes den Bereich von Interesse auf dem fluoreszierenden Bild.

Mehrere interessierende Bereiche, die mit einzelnen Kreisen markiert sind, können auf einer einzelnen Probe ausgewählt werden. Die annotierten Bilder werden automatisch in der Spektrumdatenbank gespeichert. Wählen Sie nun im Menüleistenbereich oben auf dem Bildschirm „Analysieren“, wenn das Analysefenster erscheint, wählen Sie „histo RX aqua Analyse“ aus dem Dropdown-Menü.

Wenn Sie bereit sind, beginnen Sie, indem Sie die Schaltfläche „Analysieren“ drücken. Ein minimiertes Konsolenfenster wird in der Windows-Taskleiste erscheinen und den Fortschritt der Übertragung der Bilder aus der Spectrum-Datenbank auf den lokalen Computer anzeigen. Sobald die Daten übertragen wurden, wird die aqua-Analyse gestartet, um anhand eines unüberwachten aqua-Bewertungsalgorithmus, der auf der Datenclustering-Analyse eines ersten Schwellenwerts basiert – dem Pan-Cytokeratin-Bildsignal oberhalb des Hintergrundbildsignals – einen aqua-Score zu generieren. Dies ermöglicht die Nutzung der Pixel zur Definition einer Tumormaske, die anschließend für weitere Berechnungen verwendet werden kann.

Verwenden Sie die hochexprimierenden Pan-Zytokeratin-Pixel auch zur Definition der zytoplasmatischen bzw. nicht-nukleären Bereiche der Tumorzellen. Wie hier zu sehen ist, werden Pixel mit einem hohen Signal im DPI-Kanal, die innerhalb der Tumormaske liegen, als nukleärer Natur identifiziert. Falls bei der Überprüfung Felder identifiziert werden, die aufgrund von Probenvorbereitungs- oder Bildgebungsartefakten nicht zur Bewertung geeignet sind, werden diese Felder von der Bewertung ausgeschlossen und führen ebenfalls zu einem endgültigen Ergebnis von „nicht bestanden“.

Die Ergebnisse der Aqua-Scoring-Analyse werden als Tabelle von Bewertungen dargestellt, die jeder 512 mal 512 Pixel großen Kachel im interessierenden Bereich einer gesamten Gewebeschnittprobe zugeordnet sind und die gespeichert und für nachfolgende statistische Analysen verwendet werden können. Diese mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Fotomikrografien zeigen, wie unterschiedliche Bereiche desselben Ovarialkarzinoms variable Morphologie aufweisen können. Die Detailansicht mit hoher Vergrößerung in der oberen rechten Ecke von Abbildung B hebt Zellen mit zytoplasmatischer Aufhellung und einem soliden Wachstumsmuster im oberen Tumorbereich hervor.

Der im rechten unteren Bereich von Abbildung C vergrößerte untere Teil des Gewebes weist hingegen ein homogeneres eosinophiles Zytoplasma und ein papilläres Wachstumsmuster auf. Hier sind die Heterogenitäts-Wärmekarten der ER-Expression in einem Gewebeschnitt von Ovarialkarzinom vor und nach einer Chemotherapiebehandlung in den oberen bzw. unteren Darstellungen gezeigt. Beachten Sie die Veränderung von einer variablen ER-Expression über den gesamten Schnitt mit Bereichen sowohl hoher als auch niedriger Expression in der oberen Abbildung hin zu einer gleichmäßigen Verteilung hoher ER-Expression, die in der unteren Abbildung rot dargestellt ist.

Die numerische Darstellung dieser Veränderung ist links durch die Abnahme des Simpson-Index gekennzeichnet. In dieser Abbildung sind die Heterogenitäts-Wärmekarten von HER2 in einem Gewebeschnitt von Ovarialkarzinom erneut vor und nach der Therapie dargestellt, wie in den oberen und unteren Feldern zu sehen ist. Beachten Sie erneut die Veränderung von einer variablen HER2-Expression über den gesamten Schnitt mit Bereichen sowohl hoher als auch niedriger Expression in der oberen Abbildung hin zu einer gleichmäßigen Verteilung hoher HER2-Expression in der unteren Abbildung.

Auch hier wird deutlich, dass der Simpson-Index abnimmt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Qualität der durch die computergestützte Analyse gewonnenen Daten nur so gut ist wie die Qualität der Färbung, die einem hohen technischen Standard entsprechen muss.