Eine vereinfachte Methode zur Herstellung eines ischämischen Wundmodell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Erzeugung ischämischer Wunden nicht nur bei normalen Kaninchen, sondern auch bei Kaninchen mit verminderter Widerstandskraft wie alten oder diabetischen Tieren zu ermöglichen. Alle derzeit verwendeten Techniken zur Erzeugung ischämischer Wunden sind hochgradig invasiv, und bisher kann keine dieser Techniken bei diabetischen Tieren angewendet werden. Dieses Verfahren nutzt einen minimalinvasiven chirurgischen Eingriff, der mit der Anlage von drei kleinen Hautinzisionen über den drei Gefäßbündeln beginnt.

Der nächste Schritt besteht darin, die Centrale Vena und das begleitende Gefäßbündel zu isolieren und zu schützen, sodass die Durchblutung des Ohres vermindert, aber nicht vollständig unterbunden wird. Schließlich werden die verbleibenden Gefäße, Nerven und subkutanen Gewebe durch die Hautschnitte hindurch durchtrennt oder ligiert. Die Ohrenischämie wird durch das Fehlen des arteriellen Pulses, das Erscheinungsbild des Ohres, den Temperaturunterschied sowie die subkutane Sauerstoffsättigung bestätigt.

Diese minimalinvasive Operation mag zwar schwierig durchzuführen erscheinen, ist jedoch tatsächlich sehr einfach. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Haut nur minimal verletzt. Seit wir diese Technik erstmals 2007 veröffentlicht haben, haben wir zahlreiche Fragen erhalten.

Wir haben dieses Verfahren seither weiter vereinfacht. Um es noch einfacher ohne Mikroskop durchführen zu können, wiegen Sie zunächst das ausgewählte Kaninchen und betäuben Sie das Kaninchen mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin. Überwachen Sie die Vitalzeichen des Kaninchens; drei Gefäßbündel, die das Ohr versorgen, können an der dorsalen Seite identifiziert werden.

Es gibt das zentrale Bündel, das das größte ist und über Kollateralgefäße mit anderen Gefäßen verbunden ist. Das caudale Bündel, bei dem die Arterie gewöhnlich sehr klein oder fehlend ist, sowie das kraniale Bündel. Auf der ventralen Seite erhält die distale Haut keine Durchblutung von den proximalen Gefäßen.

Stattdessen weisen die Gefäßbündel am dorsalen Ohr zahlreiche durchdringende Äste durch den Knorpel auf, um die distale ventrale Haut mit Blut zu versorgen. Bei einigen Kaninchen tritt zusätzlich ein sehr kleines subkutanes Gefäß an der ventralen Seite auf, das nicht mehr als ein Drittel der ventralen Haut mit Blut versorgt. Bei einem offenen zirkumferenziellen Hautschnitt kommt es im ventralen Schnitt im Wesentlichen zu keiner Blutung.

Bevor Sie fortfahren, vergewissern Sie sich, dass das Kaninchen nicht auf Schmerzreize reagiert, indem Sie einen Zehenquetschtest und den Augenreflex überprüfen, und schützen Sie die Augen des Tieres durch Auftragen einer künstlichen Tränen-Salbe. Halten Sie das Kaninchen während der Operation mit einer Heizplatte warm. Desinfizieren Sie dann mit Betadine und Alkohol beide Ohren und die umliegende Haut und drapieren Sie das Kaninchen so, dass nur die beiden Ohren freiliegen.

Eine Ohrmuschel wird ischämisch gemacht, während die andere als Kontrolle dient. Die für die Operation verwendeten Instrumente sind ein Skalpell mit einer Klinge der Größe 15, zwei Paar Pinzetten, eine für die Haut und eine andere für weiches Gewebe. Drei Moskitoklammern, ein oder zwei Paar gebogene Mikroscheren, ein Paar kleine Scheren zum Durchtrennen von Nähten und zähen Geweben, eine Nadelhalterzange und einige Stanzhülsen aus rostfreiem Stahl.

Beginnen Sie die Operation, indem Sie die drei vaskulären Pedikel entsprechend den Arterien und Venen identifizieren. Verwenden Sie eine Klinge Nr. 15. Führen Sie vorsichtig einen vertikalen Hautschnitt am mittleren vaskulären Pedikel durch.

Iзолieren Sie die Zentralvene aus dem umgebenden Gewebe und schützen Sie sie. Bei diesem Schritt wird die Zentralvene zum Zurückhalten umkreist.

Lösen Sie den Mittelnerv vorsichtig frei. Er befindet sich normalerweise auf der Seite der Vene, die dem Hodensack zugewandt ist. Der Nerv wird mit einer Schere durchtrennt.

Lösen Sie die A. centralis vollständig. Sie befindet sich normalerweise an der kranialen Seite und tiefer als die Vene; ligieren Sie die Arterie und durchtrennen Sie sie. Entfernen Sie das umliegende Gewebe um die V. centralis über dem Ohrkartilagin.

Ein zweiter Hautschnitt wird über dem Samenstrang angelegt, um das Bündel zu erhalten. Die Gefäße werden sorgfältig freigelegt und umschlungen, um sie zu schützen.

Dies ist besonders nützlich, wenn die Vene groß ist, wie bei diesem Kaninchen. Erstellen Sie einen Tunnel zwischen dieser und der ersten Inzision. Durchtrennen Sie das subkutane Gewebe über dem Knorpel.

Ein dritter Hautschnitt wird über dem kranialen Bündel angelegt. Dieses gesamte Bündel wird ligiert und abgetrennt. Die Haut über dem dritten Bündel wird eröffnet.

Diese Vene liegt sehr nahe unter der Haut, daher nicht zu tief schneiden. Das gesamte Gefäßbündel wird dann freigelegt, abgebunden und abgetrennt. Erstellen Sie mit einem Messer und einer Schere einen subkutanen Tunnel.

Die drei Inzisionen durchtrennen alle subkutanen Gewebe, Muskeln, Nerven und kleinen Gefäßäste. Verwenden Sie zusätzliche scharfe und stumpfe Dissektionen, um den Grund zu säubern und einen etwa fünf bis zehn Millimeter breiten, freiliegenden Knorpel freizulegen. Blutungen können durch Druck mit Mulltampons kontrolliert werden.

Elektrokauterisierung ist nicht erforderlich. Die Haut im Ohrinneren wird nicht durchtrennt, da sie kaum Blut führt. Der entscheidende Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die ausreichende Präparation des subkutanen Tunnels sicherzustellen, während die Gefäße geschützt werden.

Dies sollte kein so schwieriger Eingriff sein. Nach der Blutstillung werden die drei Hautschnitte mit vier- oder fünfsträngigen Nähten verschlossen und erneut überprüft, um sicherzustellen, dass die Hautschnitte ordnungsgemäß geschlossen sind und keine Blutung sichtbar ist. Für die Wundmedikamententestung können vier kreisförmige, vollständige Hautwunden an der Bauchseite jedes Ohres mit einem sechs Millimeter großen Edelstahlstanzwerkzeug erzeugt werden.

Der Abstand zwischen den Wunden beträgt mindestens 20 bis 30 Millimeter. Die Haut und das Perichondrium im Inneren der Stanze werden entfernt, jedoch wird der Knorpel nicht beschädigt. Nachdem die Wunden an beiden Ohren angelegt wurden, bedecken Sie diese vorübergehend mit Mullbinde und bringen das Kaninchen in einen Behandlungsraum zur Applikation des Wirkstoffs.

Nachdem die Wunden von Blutgerinnseln befreit wurden, werden die Test- und Kontrollsubstanzen appliziert. Die Wunden werden mit einer okklusiven Abdeckung versehen, um Austrocknung zu verhindern. Beim Vergleich zweier Wirkstoffe wird jede Substanz auf eine proximale und eine distale Wunde aufgetragen.

Dies berücksichtigt die unterschiedlichen Wundheilungsraten im distalen und proximalen Ohr nach der Operation. Das ischämische Ohr wird normalerweise kalt und zyanotisch und weist eine verminderte Sensibilität distal zur Inzision auf. Ein leichtes I-Ödem kann für einige Tage auftreten, verschwindet jedoch von selbst, und es ist keine Behandlung erforderlich.

Der Puls der Hauptschlagader ist nicht vorhanden. Die Ohrbewegung ist vermindert, aber nicht vollständig beseitigt, da einige Muskeln noch am Ohrenansatz befestigt sind. Wenn der Tunnel korrekt angelegt ist, ist eine deutliche Einsenkung zwischen den Einschnitten sichtbar.

Ein Fentanyl-Pflaster wird zur Linderung möglicher postoperativer Schmerzen auf der Rückenhaut befestigt. Die Hauttemperatur wird täglich an jedem Ohr mit einem Thermometer gemessen. Die Durchblutung wird im Ohr mithilfe eines transkutanen Sauerstoffspannungsmeßgeräts oder eines Laser-Doppler-Flußmeßgeräts ermittelt.

Nach einer Woche können die Nähte der Hautschnitte entfernt werden. Das Verfahren wurde an mehr als 70 Kaninchen angewandt. Dazu gehören 23 diabetische und vier alte Kaninchen.

Die Temperaturdifferenzen zwischen dem nicht-ischämischen und dem ischämischen Ohr lagen zwischen einem und zehn Grad Celsius, wobei die meisten Kaninchen im Bereich von zwei bis sechs Grad Celsius lagen. Die Temperaturdifferenz war in den frühen Tagen nach der Operation höher und nahm nach dem 15. Tag allmählich ab, blieb jedoch am Ende eines Monats noch vorhanden. Von jedem Ohr wurden sechs Gewebeproben entnommen, und der Gehalt an energiereichen Phosphaten wurde mittels HPLC sowohl an TP als auch an der Gesamtenergie gemessen.

Die Konzentrationen waren in den gesunden Ohren höher als in den ischämischen Ohren. Die Wundheilungszeiten waren bei nicht-diabetischen und diabetischen Tieren in 15 nicht-diabetischen Kaninchen stets länger am ischämischen Ohr als am nicht-ischämischen Ohr. Die durchschnittliche Heilungszeit betrug 17,8 Tage am nicht-ischämischen Ohr gegenüber 21,8 Tagen am ischämischen Ohr.

Bei 10 bis 12 Monate alten diabetischen Tieren betrug die durchschnittliche Heilzeit 18,3 Tage am nicht-ischämischen Ohr im Vergleich zu 29,1 Tagen am ischämischen Ohr. Bei allen Tieren, einschließlich diabetischer Kaninchen, heilten die Hautinzisionen normal ohne Komplikationen. Bei einer diabetischen Dauer von 24 Monaten zeigen die ventralen Wunden eine höhere Neigung zur Infektion.

Dieses Merkmal macht es menschlichen diabetischen Wunden ähnlicher. Eine histologische Probe zeigt die Heilung des subkutanen Tunnels, in dem Muskelgewebe fehlt und durch faseriges Gewebe ersetzt wird. Die Haut ist jedoch intakt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Tiere auf humane Weise zu behandeln. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Wir haben diese Technik bei mehr als 70 Kaninchen angewandt, darunter bei 23 diabetischen Kaninchen, ohne dass Komplikationen wie Blutungen oder Infektionen auftraten.

Es handelt sich um ein sehr sicheres Verfahren, wenn man diesem Vorgehen folgt. Andere Methoden wie zusätzliche Ischämie, Nervenschädigung und bakterielle Inokulation können durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu untersuchen, beispielsweise vaskuläre Ulzerationen, Druckulzera und diabetische Neuropathie.