Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI
30. Januar 2012
Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in Live-Visualisierung C. elegans Mit dem rot fluoreszierenden Farbstoff lipophil DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat), die häufig in Verwendung C. elegans Zu visualisieren umwelt ausgesetzt Neuronen. Mit diesem optimierten Protokoll werden Alen und ringförmige Strukturen Kutikula von DiI gefärbt und mit der Verbindung der Mikroskopie.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Cuticula in transparenten, lebenden Sea Elegance mit dem rot fluoreszierenden lipophilen Farbstoff Dye Eye sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem eine Population von Nematoden für die Färbung vorbereitet wird. Anschließend wird verdünnter Dye Eye der Population zugesetzt, und es erfolgt eine Inkubation.
Anschließend werden die Tiere aus der Färbelösung entnommen. Die Fluoreszenzbildgebung der mit Dai gefärbten Cuticula zeigt Oberflächendetails, einschließlich der Fortpflanzungsstrukturen der Ailey- und Ann-Augen sowie anderer äußerer morphologischer Merkmale. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Visualisierung der Cuticula bei diesem transparenten Organismus – wie direkte Bildgebung, Fluoreszenz, Transgenexpression, Antikörperfärbung, Elektronenmikroskopie und mit Weizenkeimagglutinin markiert – liegt darin, dass diese Methode einfach durchzuführen, relativ schnell und kostengünstig ist und eine hervorragende Auflösung der kutikulären Strukturen an lebenden Tieren liefert.
Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in vielen Bereichen zu beantworten, die das Modellsystem C. elegans und dessen Cuticula nutzen, wie beispielsweise Zellsekretion und Cuticula-Organisation, epidermale Zellentwicklung, heterochrone Genwege, angeborene Immunität, Entwicklung morphologischer Merkmale und die Evolution von Nematoden. Die Durchführung des Verfahrens wird Robbie Schultz, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beachten Sie beim Arbeiten mit DAPI, dass es lichtempfindlich ist.
Schützen Sie das D-Auge stets vor Licht, indem Sie es in Folie einwickeln. Tragen Sie außerdem Handschuhe und einen Laborkittel, da DMF toxisch ist und DAI ein Karzinogen ist. Cyanid-Dai ist äußerst wirksam.
Eine Standardkonzentration der Arbeitslösung beträgt 30 Mikrogramm pro Milliliter DII in M nine, und eine einzelne Population benötigt lediglich 400 Mikroliter der Arbeitslösung. Beginnen Sie mit einer 60-Millimeter-Platte, die mit unkontaminierten Nematoden besiedelt ist. Spülen Sie die Tiere mit 1,5 Millilitern 0,5 % Triton X-100 von der Platte ab.
In M-Neun-Puffer die Flüssigkeit vorsichtig in kreisförmigen Bewegungen schwenken, um alle Larven und erwachsenen Tiere zu lösen, und die Waschflüssigkeit anschließend in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Die Tiere sofort 30 Sekunden lang bei 2000 RRP M abzentrifugieren, um sie am Röhrchenboden zu sammeln. So viel Überstand wie möglich entfernen, ohne die Tiere zu stören.
Seien Sie vorsichtig, nicht gierig. Waschen Sie die Tiere mit einem Milliliter M neun. Zentrifugieren Sie und entfernen Sie den Überstand.
Wiederholen Sie die Waschung. Zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie danach 400 Mikroliter von 30 Mikrogramm pro Milliliter Dai in M9 zum Röhrchen hinzu.
Vortexen Sie das Gefäß kurz, um die Tiere erneut in Suspension zu bringen. Anschließend schütteln Sie das Gefäß für drei bis 16 Stunden bei 20 Grad Celsius in horizontaler Position mit 350 RP M in einer lichtgeschützten Umgebung. Die zeitliche Abfolge dieser letzten Schritte ist wichtig.
Zunächst muss das Triton X abgewaschen werden, bevor es Lipide entfernt, an die sich der Dai bindet. Zweitens müssen die Tiere ausreichend lange in der Farbstoff-Augen-Lösung gefärbt werden, damit die Cuticula gleichmäßig angefärbt wird. Kurz danach sollten die Tiere ausreichend lange auf Nahrung regenerieren können, um nicht gebundenes Auge zu entfernen.
Am Ende der Färbung die Tiere abzentrifugieren und die Farblösung entfernen. Die Tiere mit einem Milliliter M9 waschen. Um nicht gebundene Farbstoffe zu entfernen, die Tiere erneut abzentrifugieren und den Überstand entfernen.
Suspendieren Sie die Tiere in 400 Mikrolitern M-neun-Puffer und gießen Sie sie auf einen bakterienfreien Bereich einer NGM-Mikroplatte. Inkubieren Sie die Tiere mit OP50 E. coli beimpft im Dunkeln zur Erholung für mindestens 30 Minuten, jedoch nicht länger als einen Tag, da die Fluoreszenz der Färbung während der Erholungszeit verblassen kann. Die Tiere sollten sich von der Färbelösung wegbewegen und auf das Futter kriechen.
Diese Tiere lassen sich leichter abbilden, da sie weniger Hintergrundfluoreszenz von freier Farbstofflösung im Auge aufweisen. Beginnen Sie damit, ein Agar-Pad auf einem Objektträger vorzubereiten, um eine gleichmäßige Dicke des verwendeten Agar-Pads sicherzustellen. Verwenden Sie zwei Abstandshalter.
Ein Abstandshalter wird hergestellt, indem zwei Stücke Labor-Klebeband auf einen Objektträger geschichtet werden. Abstandshalter können unbegrenzt verwendet werden. Als Nächstes einen sauberen Objektträger längs zwischen zwei Abstandshalter-Objektträger legen und etwa 150 Mikroliter geschmolzenen Vierfach-Agar pipettieren.
Auf die Mitte des sauberen Objektträgers. Schnell die geschmolzene AER mit einem zusätzlichen Deckglas abdecken, das senkrecht über die AER und beide Abstandshalter platziert wird, um ein Agar-Präparat zu bilden. Vorsichtig das Deckglas verschieben, wobei das Präparat in der Mitte der Oberseite des Montagetragträgers verbleibt.
Pipettieren Sie nun fünf Mikroliter Nematoden-Anästhetikum auf das Objektträgerpad, bringen Sie acht bis zwölf Tiere im Anästhetikum bei und decken Sie sie vorsichtig mit einem Deckglas ab. Beobachten Sie die Tiere mit einem auflichtmikroskopischen oder konfokalen Mikroskop, das mit mindestens einer 40×-Objektivlinse und einem Trissy-Filter oder einem anderen kompatiblen Filter ausgestattet ist. Das Maximum der fluoreszenten Anregung von Dye Eye liegt bei 549 Nanometern und das Emissionsmaximum bei 565 Nanometern.
Bei gebundenen Präparaten ist die Bildgebung der anspruchsvollste Teil dieses Protokolls. Wir zeigen, wie man die Tiere zur Bildgebung montiert, doch Sie müssen ordnungsgemäß in die Verwendung des verwendeten Auflicht- oder Konfokalmikroskops eingewiesen sein. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung eines Objektivs mit mindestens 60-facher Vergrößerung am besten geeignet ist, um die durch die Färbemethode beleuchteten Details aufzulösen.
Jedes der Bilder in diesem Abschnitt wurde mit einem 63x-Objektiv an postembryonalen C. elegans aufgenommen. Die Cuticula-Oberfläche weist jährlich voneinander getrennte, durch circumferentielle Furchen unterteilte Bereiche auf und in einigen Entwicklungsstadien longitudinale Erhebungen, die als Ailey bezeichnet werden. Jedes der Bilder in diesem Abschnitt wurde mit einem 63x-Objektiv an postembryonalen C. elegans aufgenommen.
Die Kutikula-Oberfläche weist jährlich angeordnete Abschnitte auf, die durch kreisförmige Furchen getrennt sind, sowie in einigen Stadien längs verlaufende Erhebungen, die als Aley bezeichnet werden. Jedes Entwicklungsstadium weist Kutikula-Strukturen mit charakteristischen Zusammensetzungen und Mustern auf, wobei sowohl Aley als auch Aly fluoreszierend angefärbt werden können, abhängig von der Oberflächenzusammensetzung.
Bei Verwendung dieser Farbstoff-Standmethode bleiben sie in allen Larven- und Erwachsenenstadien bis zu einem Tag nach der Wiederherstellung sichtbar. Gelegentlich treten fluoreszierende Hintergrundpartikel auf, jedoch nicht regelmäßig. Dies ist die Cuticula erwachsener mutanter Tiere mit mäßigen Defekten in der Cuticula-Organisation.
Ailey-Kiele sind diskontinuierlich und zusätzlich vorhanden. Ailey-Kiele sind verschmolzen und verzweigt oder geteilt, ein gemeinsamer transgener Marker. Ein dominantes Roll-sechs-Allel verursacht eine Verdrehung der Cuticula, die bei der Ailey sichtbar ist und dazu führen kann, dass die Annuli unregelmäßig angeordnet sind.
Dai färbt auch andere äußere Cuticula-Strukturen, einschließlich der adulten hermaphroditischen Vulva und des adulten männlichen Schwanzes; Dai kann außerdem subtile Defekte in der äußeren Morphologie wie diesen gegabelten Schwanz hervorheben, jedoch bei unzureichender Färbung. Beispielsweise führt eine zweistündige Färbung zu einer fleckigen Cuticula-Färbung, obwohl umweltexponierte Neuronen angefärbt werden können. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in vier Stunden durchgeführt werden, nicht einschließlich der Bildgebung, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man C. elegans mit DiI färbt, um Cuticula und andere äußere morphologische Strukturen zu beobachten.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Visualisierung der Cuticula in lebenden C. elegans mithilfe des rot fluoreszierenden lipophilen Farbstoffs DiI vorgestellt. Das optimierte Protokoll ermöglicht die Beobachtung von Alae und annularen cuticulären Strukturen mittels zusammengesetzter Mikroskopie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Die Visualisierung des Cuticula bei transparenten Organismen ist entscheidend für die Untersuchung der Morphologie.
- Zu den bestehenden Methoden gehören die direkte Bildgebung und die Antikörperfärbung.
- DiI wird üblicherweise zur Visualisierung von Neuronen in C. elegans verwendet.
- Ziel dieser Studie ist es, die Visualisierung kutikularer Strukturen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer einfachen und effektiven Methode zur Färbung des Cuticula bei lebenden C. elegans.
- Verbesserung der Auflösung bei der Abbildung der Cuticula-Struktur.
- Bereitstellung einer kostengünstigen Alternative zu bestehenden Visualisierungstechniken.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Population von C. elegans zur Färbung.
- Incubation der Nematoden in verdünnter DiI-Farbstofflösung.
- Wiederherstellung der Tiere aus der Färbelösung.
- Fluoreszenzbildgebung zur Beobachtung gefärbter kutikularer Strukturen.
Hauptergebnisse
- Die DiI-Färbung hebt Alae- und annuläre Strukturen effektiv hervor.
- Die Fluoreszenzbildgebung zeigt die detaillierte Oberflächenmorphologie.
- Die Methode ist schnell, einfach durchzuführen und kostengünstig.
- Die Ergebnisse zeigen eine hohe Auflösung kutikularer Strukturen bei lebenden Tieren.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden.
- Sie ermöglicht eine detaillierte Visualisierung kutikulärer Merkmale bei lebenden C. elegans.
- Die Methode kann für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen breit eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Visualisierung kutikularer Strukturen in lebenden C. elegans ermöglicht eine mechanistische Absicherung von Signalwegen der epidermalen Entwicklung und der Organisation der Cuticula. Diese Methode unterstützt die Target-Validierung, indem sie quantitative phänotypische Endpunkte für genetische und pharmakologische Störungen bereitstellt. Der Ansatz bietet in der frühen Entdeckungsphase Vorhersagesicherheit, indem er die Morphologie der Cuticula mit Beweglichkeit, angeborener Immunität und Modellen der Nematoden-Evolution verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Bezug auf die Organisation von Cuticula-Collagenen und die Entwicklung epidermaler Zellen.
- Operationaler Wert: Bietet einen robusten, reproduzierbaren Assay zur funktionellen Target-Validierung in nematodenbasierten Krankheitsmodellen.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem er Cuticula-Defekte mit morphologischen Merkmalen und heterochronen Genwegen verknüpft.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert hochauflösende fluoreszierende Signale von Annulli, Alae, Vulva und Schwanzstrukturen für die Wirkstoff-Screening.
- Operationaler Wert: Bietet ein schnelles, kostengünstiges und skalierbares Färbeprotokoll, das mit Imaging-Workflows an lebenden Tieren kompatibel ist.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Erzeugt standardisierte, quantifizierbare morphologische Ergebnisse für die nachgeschaltete Validierung von Hits und die Identifizierung von Leitstrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Visualisierung der Cuticula mit präklinischen Modellen der angeborenen Immunität und Entwicklungsstörungen.
- Mechanistische Risikominimierung: Ermöglicht die Beobachtung von Cuticula-Defekten bei Mutanten und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern für die epidermale Integrität.
- Krankheitsrelevante Systematik: Anwendbar auf Studien zur Nematoden-Evolution und zur Entwicklung morphologischer Merkmale, die für die Wirkstoffprüfung gegen Parasiten relevant sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen über das phänotypische Screening bis zur präklinischen Validierung ein und ermöglicht eine iterative Verbesserung von Verbindungen, die die Kutikula modulieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen zur Kutikulaorganisation und epidermaler Sekretion durch direkte Visualisierung struktureller Störungen.
- Screening: Ermöglicht bereit für Assays, reproduzierbare Färbungen mit quantitativen bildgebenden Ausgaben zur Bewertung von Substanzeffekten.
- Analytik: Bietet fluoreszenzbasierte Messgrößen zur Kutikulaintegrität und ermöglicht statistische Vergleiche über genetische oder Behandlungsbedingungen hinweg.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem kutikuläre Strukturen visualisiert werden, die mit Beweglichkeits- und Immunphänotypen assoziiert sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform für Längsschnittstudien kutikulärer Dynamiken über Entwicklungsstadien und genetische Hintergründe hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem die mechanistische Mehrdeutigkeit in kutikulären Wegen verringert wird.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Labore hinweg sicher, indem ein einfaches, kosteneffektives Protokoll verwendet wird.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine frühzeitige Erkennung kutikelvermittelter Toxizitäts- oder Wirksamkeitssignale ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf der Schwere und Umkehrbarkeit kutikulärer Phänotypen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Fluoreszenzmikroskopie und im Umgang mit lebenden Tieren.
- Benötigt Zugang zu Auflicht- oder konfokalen Mikroskopen mit geeigneten Filterkombinationen (Anregung 549 nm, Emission 565 nm).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei Färbungsdauer, Waschschritten und Erholungsbedingungen voraus, um die Variabilität zu minimieren.
- Erfordert Anpassungen je nach C. elegans-Stamm und Entwicklungsstadium aufgrund unterschiedlicher Cuticula-Zusammensetzung.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Photobleiche der Farbstoffe während der Erholungsphase und eine mögliche Hintergrundfluoreszenz durch nicht gebundenen Farbstoff.
