Nach Cell-Schicksal

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops der Sulfatverteilung in E. coli in Echtzeit nach einer Infektion mit dem Phagen Lambda zu folgen. Erstellen Sie zunächst ein grobes Lysat des Phagen Lambda. Anschließend reinigen Sie den Phagen und infizieren E. coli im Reagenzglas mit dem Phagen Lambda.

Verfolgen Sie weiterhin das Schicksal der Bakterienzellen unter dem Mikroskop. Letztendlich können die Ergebnisse in Echtzeit unterschiedliche Zellschicksale in E. coli zeigen, basierend auf der Expression verschiedener fluoreszierender Proteine, die mit Zellwachstum oder Zelltod assoziiert sind. Eine wichtige Überprüfung dieses Verfahrens liegt in der Herstellung einer gereinigten Front und einer markierten FI-Stammlösung.

Um eine Teilung der Fige während der Vorbereitung und Reinigung zu vermeiden, optimieren Sie auch die Bildgebungsparameter am Mikroskop, um ein gesundes Zellwachstum zu ermöglichen. Inokulieren Sie eine Übernachtkultur von E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in LBM-Medien bei einer Zelldichte von OD 600 von etwa 0,6 und induzieren Sie die Lygen in einem Wasserbadrührer bei 42 Grad Celsius.

Weiter bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis eine Lyse erkennbar ist. Die Kultur wird klar. Nun 2 % Chloroform hinzufügen und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Überführen Sie anschließend das Phagenlysat in 250-Milliliter-Flaschen und zentrifugieren Sie die Kultur. Gewinnen Sie dann den Überstand, der die Phagenpartikel enthält, und führen Sie eine zweite Zentrifugation durch, um sichtbare Rückstände gemäß standardmäßigen Phagentitrationsprotokollen zu entfernen. Bestimmen Sie die Phagenkonzentration, reinigen Sie die Phagen anschließend über einen Cäsiumchlorid-Gradienten und prüfen Sie die Aktivität mittels DPI zur Herstellung von Aro-Platten.

Reinigen Sie sechs Objektträger mit 70 % Ethanol. Ordnen Sie fünf Objektträger wie gezeigt an und sichern Sie sie mit Klebeband. Gießen Sie nun eine Lösung von 1,5 % Aros in Medium auf die befestigten Objektträger.

Platzieren Sie die letzte Objektträgerplatte oben darauf und vermeiden Sie sorgfältig Luftblasen. Legen Sie ein Gewicht darauf und lassen Sie das AROS etwa 30 Minuten abkühlen. Entfernen Sie die vier seitlichen Objektträgerplatten und verpacken Sie den Objektträgerblock mit Frischhaltefolie.

Unter Verwendung einer Übernachtkultur transformierter Bakterien als Inokulum eine Kultur in LBMM ansetzen, einen Milliliter Bakterien pelletieren und resuspendieren. Die Zellen in 20 Mikroliter eiskaltem LBMM mit einer breiten Pipettenspitze suspendieren.

Fügen Sie 20 Mikroliter gereinigten Phagen hinzu. Vorsichtig mischen und zunächst 30 Minuten auf Eis inkubieren, um die Phagenabsorption zu ermöglichen. Anschließend fünf Minuten im Wasserbad bei 35 Grad Celsius.

Um die Phagen-DNA-Injektion auszulösen, lösen Sie zelluläre Aggregate durch Mischen auf. Verdünnen Sie die Mischung im Verhältnis 1:10 in LBMM. Stellen Sie nun eine LBM-Agroschale bereit.

Auf einen Deckgläser geben Sie einen Mikroliter der Phagen-Zell-Mischung. Sobald diese absorbiert ist, platzieren Sie vorsichtig einen weiteren Deckgläser darauf. Beginnen Sie mit der Aufnahme eines Bildsatzes über den YFP-Kanal für den ersten Zeitrahmen.

Nehmen Sie eine Serie von 15 Bildern in 200 Nanometer Z-Achsen-Intervallen auf. Zusätzlich nehmen Sie ein einzelnes scharfes Bild durch die Phasenkontrast- und mCherry-Kanäle auf. Anschließend erfassen Sie einen Zeitrafferfilm des Zellverhaltens nach der Infektion.

Um die Ausbleichung und Phototoxizität während der Zeitrafferaufnahme zu minimieren, verwenden Sie pro Zeitpunkt ein einzelnes Z-Positionsbild pro Kanal und nehmen Sie die Probe in den Phasenkontrast-, YFP- und mCherry-Kanälen in Zeitintervallen von 10 Minuten über einen Zeitraum von etwa vier Stunden auf. Beginnen Sie die Analyse der Bilder mit einer manuellen Zählung der Phagen und notieren Sie außerdem die Phagenlokalisation sowie die Zelllänge. Vermerken Sie im initialen Zeitraum die Zellschicksale lytisch, lysogen oder nicht infiziert.

Dokumentieren Sie außerdem die Lysezeit und alle weiteren gewünschten Informationen, indem Sie den Zeitrafferfilm abspielen, und gewinnen Sie weitere quantitative Daten, wie beispielsweise den Fluoreszenzpegel über die Zeit in einzelnen Zellen, mithilfe automatisierter Algorithmen zur Zellerkennung und Linienverfolgung. Typischerweise sind die Plaques der fluoreszenzmarkierten Phagen deutlich kleiner als die des Wildtyps, und die YFP- und DAPI-Signale eines erfolgreich gereinigten Phagen colokalisieren. Diese Daten kombinieren Bildserien aus den Phasenkontrast-, YFP- und mCherry-Kanälen sowie die entsprechenden überlagerten Bilder aus einem Zeitrafferfilm.

Die einzelnen Phagen sind im Anfangszeitraum deutlich sichtbar. Hier sieht man zwei Zellen, von denen jede von einem einzelnen Phagen infiziert ist, und eine Zelle, die von drei Phagen infiziert ist. Typischerweise befinden sich mehrere Phagen auf der Zelloberfläche, während andere Phagen nicht adsorbiert sind.

Im Laufe der Zeit wird das Infektionsergebnis unterscheidbar. 80 Minuten später haben sich die beiden Zellen, die jeweils durch einzelne Phagen infiziert wurden, in den lytischen Weg begeben. Bei intrazellulärer Produktion neuer Phagen hat die durch drei Phagen infizierte Zelle den lysogenen Weg eingeschlagen, gekennzeichnet durch die Produktion von mCherry aus dem Prä-Motor.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine gereinigte Phagenstammlösung herstellt, um E. coli-Bakterien mit dem Phagen Lambda zu infizieren, und wie man die Lebensweise in Echtzeit unter dem Mikroskop bildlich darstellt.