Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

In diesem Video werden die Kinase- und Phosphataseaktivitäten während des gesamten Zellzyklus mittels Förster-Resonanzenergietransfer oder FRET überwacht. Hier ist an einem Ende einer Aktivitäts-Sonde für die polo-ähnliche Kinase 1 oder PLK1 ein cyan fluoreszierendes Protein (CFP) und am anderen Ende ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) angebracht. Diese Sonde wird in U2-OS-Zellen transfiziert.

Dann, um den Phosphorylierungsstatus von LK zu untersuchen, das während des Übergangs von G2 in M wirkt, werden die transfizierten U2-OS-Zellen einer zeitaufgelösten Fluoreszenzbildgebung unterzogen. Wenn CFP und YFP räumlich nahe beieinander liegen und CFP angeregt wird, erfolgt eine Energietransferierung auf YFP, und die Emission von YFP kann detektiert werden. Wenn jedoch die Sonde phosphoryliert wird, führt eine konformationelle Änderung des Proteins zu einer Trennung von CFP und YFP.

Wenn nun CFP angeregt wird, werden eine starke CFP-Emission und nur eine schwache YFP-Emission detektiert. Die Quantifizierung des Verhältnisses der YFP-Emission nach Anregung sowohl von CFP als auch von YFP zeigt, dass die PLK1-Aktivität in der G2-Phase ansteigt und während der Mitose ihr Maximum erreicht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der herkömmlichen zeitraffenden Mikroskopie liegt also darin, dass sichergestellt wird, dass der Zellzyklus weder durch die Aufnahmebedingungen noch durch die Expression eines Sondenmoleküls gestört wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Zellzyklus zu beantworten, beispielsweise wo und wann bestimmte Kinasen oder Phosphatasen aktiviert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in zellzyklusregulierte Enzyme ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, bei denen unbehandelte Bedingungen erforderlich sind, wie beispielsweise Proliferationsassays von Zellen. Um den menschlichen Zellzyklus zu überwachen, werden U2 OS-Zellen mit einer auf FRET basierenden PKA-Aktivitäts-Sonde transfiziert. Mithilfe eines standardmäßigen Calciumphosphat-Transfektionsverfahrens werden die Zellen mindestens sieben Tage lang in Puromycin selektiert.

Dadurch wird die Population von Zellen angereichert, die die Sonde exprimieren, und die Anzahl von Zellen mit toxischen Expressionsniveaus oder Expressionsniveaus, die den Zellzyklus stark beeinträchtigen, wird begrenzt. Anschließend werden stabile Klone durch limitierte Verdünnung ausgewählt, und die Expression von CFP und YFP wird überprüft, um sicherzustellen, dass beide in allen Zellen in etwa im gleichen Verhältnis vorliegen. Falls einige Zellen nur CFP oder nur YFP enthalten, ist in diesem Fall wahrscheinlich eine Rekombination aufgetreten; wiederholen Sie dann die Plasmidpräparation unter Verwendung von Bakterien, die weniger anfällig für homologe Rekombination sind, wie zum Beispiel SureTwo-Zellen, linearisieren Sie anschließend das Plasmid und wiederholen Sie die Transfektion.

Wenn die Zellen den Sensor stabil exprimieren, säen Sie sie auf Deckglas-Schalen der Größe 1,5 aus, nachdem sie angeheftet sind und eine Konfluenz von 30 bis 50 % erreicht haben. Wechseln Sie das Medium zu einem CO2-unabhängigen Medium, das kein Phenolrot enthält, und platzieren Sie die Zellen auf einem motorisierten Epi-Fluoreszenzmikroskop mit Temperaturregelung bei 37 Grad Celsius. Das Mikroskop sollte mit Anregungs- und Emissionsfiltern für CFP und YFP ausgestattet sein.

Ein für die Überwachung von CFP und YFP geeigneter ROIC-Spiegel und ein Objektiv, das für die erforderliche Auflösung geeignet ist. Hier wird ein 20x-NA-0,75-Luftobjektiv verwendet. Bringen Sie die Zellen mithilfe von durchgehendem Licht in den Fokus.

Verwenden Sie an dieser Stelle kein fluoreszierendes Licht, da es eine Stressreaktion auslösen würde, die den Zellzyklus stören könnte. Um Phototoxizität zu vermeiden, stellen Sie die Biegeauflösung auf das maximal verfügbare Maß ein, das die erforderliche subzelluläre Auflösung ermöglicht. Bei diesem Experiment sollte es möglich sein, den Zellkern und das Zytoplasma voneinander zu unterscheiden.

Stellen Sie eine kurze Belichtungszeit ein und setzen Sie einen starken Neutraldichtefilter ein. Erstellen Sie dann ein Testbild mit 12 oder 16 Bit unter Verwendung der YFP-Anregung und -Emission. Passen Sie die Belichtungszeit und die Neutraldichtefilter so an, dass die durchschnittliche Intensität in einer Zelle ungefähr der Hintergrundintensität plus dem Fünffachen der Differenz zwischen minimaler und maximaler Hintergrundintensität entspricht. Um zu überprüfen, ob die Bilder nicht gesättigt sind, untersuchen Sie die Fluoreszenzintensität des Probenbilds.

Die maximale Intensität im Bild sollte weniger als die Hälfte des dynamischen Bereichs betragen, um Intensitätsunterschiede zu ermöglichen, wenn Zellen in die Mitose eintreten. Wiederholen Sie anschließend diesen Vorgang unter Verwendung von CFP-Anregungs- und YFP-Emissionsfiltern. Wählen Sie mehrere Bereiche mit transfizierten Zellen aus, wobei die Bereiche, die für die Fokussierung und die Optimierung der Belichtungsbedingungen verwendet wurden, ausgeschlossen werden.

Da diese Verfahren eine Stressantwort hervorrufen können, sicherstellen, dass die maximale Intensität in allen Zellen unterhalb der Hälfte des dynamischen Bereichs liegt. Die Software anweisen, alle 45 Minuten zwei Bilder mit YFP-Anregung, YFP-Emission und CFP-Anregung aufzunehmen. YFP-Emissionsfilter.

Stellen Sie außerdem sicher, dass die Gesamtdauer des Experiments länger ist als die Dauer des Zellzyklus. Sobald alles eingestellt ist, beginnen Sie mit der Bildaufnahme. Nach Abschluss der Aufnahme öffnen Sie die aufgenommenen Bilder und verfolgen Sie die Zellzyklusdauer von Mitose zu Mitose. Bei Zellen, die hier die transfizierte Sonde exprimieren, betrug die Zellzyklusdauer etwa 20 bis 25 Stunden.

Vergleichen Sie dies mit Kontrolldaten für den verwendeten Zelltyp. Wenn die Zellzyklusdauer den Referenzzeitpunkten entspricht, kann die FRET-Analyse durchgeführt werden. Sobald die Zeitpunkte verifiziert wurden, können die Bilder analysiert werden.

Die Analyse kann mit den meisten Programmen durchgeführt werden, die für die Mikroskopie vorgesehen sind. Hier wird die kostenlose Software ImageJ mit dem Ratio-Plus-Plugin verwendet. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie die Bilder in ImageJ öffnen. Wenn sich die Bilder im Multicolor-Stack-Format befinden, trennen Sie die einzelnen Kanäle, indem Sie sie in einen Hyperstack umwandeln, indem Sie Bild auswählen.

Dann Hyperstack, dann Stapel zu Hyperstack konvertieren. Das Fenster „In Hyperstack konvertieren“ öffnet sich mit den angezeigten Einstellungen; klicken Sie auf „OK“. Das Bild wird nun mit zwei Schiebereglern darunter angezeigt.

Um die Bilder als Einzelkanal-Stapel zu trennen, klicken Sie auf das Bild und wählen Sie „Hyperstack – Dimensionalität reduzieren“. Dadurch öffnet sich das Fenster zur Dimensionsreduktion; stellen Sie sicher, dass „Frames“ und „Quelle beibehalten“ ausgewählt sind. Klicken Sie anschließend auf „OK“.

Ein neues Bild, das nur einen Kanal enthält, wird angezeigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um ein neues Bild mit dem zweiten Kanal aufzurufen. Wählen Sie anschließend den YFP-Anregungs-YFP-Emissions-Stack aus, um die visuelle Klarheit der endgültigen Bilder zu verbessern.

Klicken Sie auf „Process“ und dann auf „Math“. Anschließend multiplizieren Sie. Wenn das Multiplikationsfenster geöffnet wird, geben Sie drei ein, um den YFP-Anregungs-YFP-Emissions-Stack mit drei zu multiplizieren. Dieser Schritt ist optional und stellt sicher, dass die Verhältnisse nicht im Bereich zwischen null und eins liegen.

Als Nächstes wählen Sie auf der Bild-J-Symbolleiste das Freihand-Werkzeug aus. Zeichnen Sie dann im YFP-Anregungs-, YFP-Emissions-Stack einen interessierenden Bereich oder ROI in einem zellfreien Bereich, der jedoch nahe an einer Zelle liegt, die gemessen werden soll. Um den ROI dem ROI-Manager hinzuzufügen, klicken Sie auf Analysewerkzeuge und anschließend auf ROI-Manager.

Das Fenster des ROI-Managers wird angezeigt. Klicken Sie auf „Hinzufügen“, um die ROI-Koordinaten zu speichern, um die durchschnittliche Intensität des ROI im YFP-Anregungs-YFP-Emissions-Stack zu messen. Klicken Sie auf „Analysieren“ und dann auf „Messen“.

Das Ergebnisfenster wird geöffnet. Wählen Sie den CFP-Anregungs-YFP-Emissions-Stack aus. Doppelklicken Sie dann auf die ROI im ROI-Manager und wiederholen Sie die Messung.

Die Messung wird zum Ergebnisfenster hinzugefügt. Blättern Sie zu anderen Positionen im Stapel, um diesen Vorgang zu mehreren Zeitpunkten zu wiederholen. Überprüfen Sie, ob die Hintergrundintensitäten in der Nähe der Zelle von Interesse während des gesamten Films ähnlich sind, indem Sie die Messungen im Ergebnisfenster vergleichen.

Um die Messungen auf minimale Intensität einzustellen, klicken Sie auf „Analyze“ und dann auf „Set Measurements“ und geben Sie den minimalen und maximalen Grauwert an. Daraufhin erscheint ein Fenster mit Messoptionen. Nachdem Sie Helligkeit und Kontrast nach Bedarf angepasst haben, zeichnen Sie eine ROI, die den größten Teil einer Zelle abdeckt, und messen Sie die minimale Intensität in beiden Stacks.

Danach Messungen wie zuvor durchführen, diesmal jedoch unter Verwendung einer Zelle anstelle des Hintergrunds. Anhand der Werte aus den Ergebnisabschnitten berechnen Sie die Differenz zwischen der gemessenen minimalen Intensität und der Hintergrundintensität und teilen diese durch zwei. Dies liefert eine erste Schätzung für einen Clipping-Wert, um das Verhältnis sowie die Auswahl von Plugins zu öffnen.

Dann Verhältnis plus. Anschließend für das FRET-Verhältnis die CFP-Anregung YFP-Emission S-Stapel eins auswählen oder für das invertierte FRET-Verhältnis zur Visualisierung von Sonden, bei denen die FRET-Effizienz nach Phosphorylierung abnimmt. Die YFP-Anregung YFP-Emission S-Stapel eins auswählen, um die gemessenen Hintergrundintensitäten und Abschneidewerte einzufügen.

Verwenden Sie die Werte aus dem Ergebnisfenster und fügen Sie sie in das Verhältnis-Plus-Fenster ein. Stellen Sie die Skalierung des resultierenden Verhältnis-Stapels ein und wenden Sie eine geeignete Farbtabelle an, um Verhältnisänderungen zu visualisieren. U2-OS-Zellen, die eine FRET-basierte Sonde zur Überwachung der PLK1-Aktivität exprimieren, wurden wie in diesem Video beschrieben 60 Stunden lang aufgezeichnet.

Dieses Bild zeigt den kumulativen Eintritt in die Mitose von 50 Zellen, die den FRET-Sonde ausdrücken, einschließlich der Teilungen der Tochterzellen. Die Mehrheit der Zellen, die die Sonde exprimieren, proliferiert mit einer Zellzyklusdauer zwischen 20 und 25 Stunden, was darauf hinweist, dass die Bildgebungsbedingungen und die Expressionslevel der Sonde den Zeitpunkt des Zellzyklus nicht beeinflussen. Eine Falschfarbendarstellung des invertierten FRET-Verhältnisses, bei der eine Zelle über vier Teilungen verfolgt wird, zeigt, dass trotz erheblichem Rauschen ein Trend erkennbar ist, gemäß dem die PK1-Aktivität in G2 zunimmt und während der Mitose ihr Maximum erreicht.

Wenn die Rohdaten mittelwertgefiltert sind und als Diagramm dargestellt werden, lässt sich die Zeit zwischen Aktivitätsspitzen leicht abschätzen. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung des invertierten FRET-Verhältnisses der Zelle aus den vorherigen Bildern, dargestellt im Graphen. Der Zeitpunkt der Aktivierung kann abgeschätzt werden, und wie hier zu sehen ist, wird die Phosphorylierung des Sondenmoleküls etwa vier Stunden vor dem Maximum der Phosphorylierung in der Mitose sichtbar.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellen in einem unbelasteten Zustand zu halten, was durch die Minimierung der Lichteinwirkung sowie von Temperatur- oder pH-Änderungen erreicht wird. Es ist außerdem wichtig zu beachten, dass diese Methode das Gleichgewicht zwischen der Kinase- und Phosphatase-Aktivität in einer Zelle überwacht. Dieses Verfahren kann mit RNA-Interferenz oder Inhibitoren-Screens kombiniert werden, um die upstream liegenden Regulatoren dieser Kinase- und Phosphatasen zu identifizieren.