Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

Dieses Verfahren ermöglicht die Echtzeitüberwachung des Oligo-DDR-Gliazelltods. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst kultiviert und anschließend für die Live-Cell-Abbildung vorbereitet werden. Im nächsten Schritt werden die Zellen einer Behandlung unterzogen und die Effekte mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht.

Der letzte Schritt besteht in der Durchführung der Datenanalyse. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die Raten des Zelltods in einer Zellpopulation nach einer Behandlung oder Reizung an, indem die nukleare Fluoreszenz eines caspasenaktivierten Fluoreszenzfarbstoffs überwacht wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Immunfärbung liegt in der Möglichkeit, mehrere Zeitpunkte gleichzeitig zu erfassen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Zellbiologie beantworten, beispielsweise bezüglich der Reaktionen auf pharmakologische, reagentielle und verschiedene andere Behandlungen. Aktuell ermöglicht diese Methode Einblicke in den Zelltod innerhalb von Zellkulturen. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewandt werden, wie zum Beispiel ex vivo- und organotypische Gewebe, einschließlich Hirnschnitten.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, während sie sich daran gewöhnen, mit lebendem Gewebe anstelle von fixiertem Gewebe zu arbeiten. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da im Vergleich zu fixiertem Gewebe viele Schritte zur Vorbereitung von lebenden Zellproben erforderlich sind. Tauen Sie zunächst gefrorene immortalisierte N 19 Oligo droog gliale Zellen in einem Wasserbad von 37 Grad Celsius auf, während die Zellen auftauen.

Geben Sie sieben Milliliter High-Glucose-DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, in eine 10 cm große Kulturschale. Anschließend die Zellsuspension tropfenweise auf die Platte geben und die Petrischale vorsichtig schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Kultivieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 34 Grad Celsius in einem CO₂-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, nachdem vier Stunden verstrichen sind.

Entfernen Sie das Medium von den Platten, um verbleibendes DMSO-Cryoprotektivmittel zu eliminieren. Ersetzen Sie es nach vier bis sieben Tagen Wachstum durch sieben Milliliter frisches Medium. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, aspirieren Sie das Medium und pipettieren Sie einen Milliliter Dispersion auf den Zellrasen, inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Dann ernten Sie die Zellen und säen Sie diese in eine 10 cm große Zellkulturschale mit den geernteten Zellen in einer Dichte von 0,1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter aus, und stellen Sie diese Schale in den Zellkulturtrockenschrank. Nach einer weiteren Passage können die Zellen für Live-Cell-Imaging-Experimente ausgesät werden. Gehen Sie dazu wie zuvor vor, um die Zellen zu ernten, entnehmen Sie dann 30 µL der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers.

Verwenden Sie anschließend sterile Pinzette, um unbeschichtete Glasdeckgläser zu platzieren. Geben Sie in die Vertiefungen einer 6-Loch-Platte Zellen mit einer Dichte von 0,1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in die Vertiefung. Lassen Sie die Zellen über Nacht in zwei Milliliter phenolfreiem DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, bei 34 °C und 5 % Kohlendioxid wachsen.

Am nächsten Tag 100 Mikroliter serumfreies Medium mit 0,5 bis vier Mikrogramm gereinigtem Plasmid-DNA und vier Mikrolitern FU-Gene-HD mischen. Die Mischung vorsichtig zweimal verwirbeln und anschließend die DNA fünf Minuten bei Raumtemperatur komplexieren lassen. Nach Ablauf der Inkubationszeit die FU-Gene-HD-DNA-Mischung direkt den kultivierten Zellen hinzufügen.

Kippen Sie die Platte vorsichtig, um die Flüssigkeit zu mischen. Kultivieren Sie die Zellen anschließend weitere 48 Stunden bei 34 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie mit der Behandlung oder den Experimenten fortfahren. Schalten Sie zuerst das Steuergerät des LCI Cham Light Live-Cell-Instruments ein.

Dies sollte drei Stunden vor Versuchsbeginn erfolgen, um eine gründliche Aufwärmung des Stages sicherzustellen. Mindestens eine Stunde vor Versuchsbeginn sollte die Steuerbox eingeschaltet werden. Anschließend im Flussbrüschensprüh die LCI Cham light magnetische Kulturkammer und die Pinzette mit 70 % Ethanol ein und lassen Sie sie fünf Minuten lang trocknen.

Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie gesund sind. Die Zellen sollten auf dem Glasdeckchen dicht und gut ausgebreitet erscheinen und zahlreiche Membranausläufer aufweisen. Zellen mit einer verminderten Anzahl an Ausläufern oder einem unregelmäßig geformten Zellkern sind vermutlich durch die Transfektion belastet und für weitere Experimente im Flusshaubenarbeitsbereich ungeeignet.

Neigen Sie die 6-Loch-Platte und entfernen Sie die Deckgläser mit einer Pinzette. Legen Sie die Deckgläser schnell mit der Zellseite nach oben in die untere Kammerplatte. Lassen Sie die Deckgläser nicht austrocknen.

Befestigen Sie anschließend den magnetischen Hauptkörper der Kulturkammer und geben Sie 500 µL Medium aus der ursprünglichen 6-Loch-Platte auf die Oberseite des Deckgläschens. Die Wiederverwendung des Mediums verringert die durch Umweltveränderungen verursachten Belastungen für die Zellen und kann außerdem nützlich sein, um extrazellulär sezernierte Faktoren zu bewerten. Nachdem das Medium hinzugefügt wurde, setzen Sie das Glasdeckel auf die Kulturkammer und verwenden Sie einen Kim-Tücher-Zopf mit 70 %, um rückständige Materialien von der Unterseite des Deckgläschens zu entfernen, die die Mikroskopie stören könnten.

Stellen Sie die Kulturkammer für 30 Minuten in den Inkubator bei 34 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Kammer selbst auf 34 Grad erwärmt wird, um eine Verschiebung des Deckglases zu vermeiden. Während das Metall erwärmt, ist es notwendig, bei den folgenden Schritten die Umgebungsbeleuchtung so gering wie möglich zu halten.

Zunächst hatte Thora zuvor Elektra mit Nuklearblick bei Raumtemperatur vorbereitet. Danach entnehmen Sie die Kulturkammer aus dem Inkubator und stellen sie schnell in die Umgebungskammer des Mikroskops. Schalten Sie den mit 5 % vorgegasten Kohlendioxid-Behälter mit Doppelregler ein.

Danach unter Verwendung des 10-fachen Objektivs mit der Mikroskoplampe auf etwa 2,5 Volt eingestellt und der Belichtungszeit auf 240 Millisekunden. Fokussieren Sie mit Hellfeldmikroskopie, um die Zellen auf dem Computermonitor sichtbar zu machen. Anschließend geben Sie eine 80 Millimolar konzentrierte Kaliumionenlösung oder einen anderen Apoptoseinduktor über Medienaustausch mit langsamer und lokaler Perfusionszufuhr mittels einer peristaltischen Pumpe zu den Zellen hinzu.

Das Nuke View 4 88 Substrat ist in der Zellkultur für Experimente stabil, die bis zu 36 Stunden dauern. Daher ist es möglich, Experimente über diesen Zeitraum durchzuführen. Richten Sie zuerst das Mikroskop so ein, dass die Fluoreszenz von rotem und grünem fluoreszierendem Protein sichtbar wird.

Klicken Sie dann auf den roten Kanal, um die transfizierten Zellen anzuzeigen. Wählen Sie etwa 12 Bilder mit mehreren transfizierten Zellen aus und speichern Sie diese XY-Bühnenpositionen. Lassen Sie das Mikroskop alle sechs Minuten an diesen gespeicherten Positionen Bilder im Hellfeld, roten Kanal und grünen Kanal aufnehmen.

Nach der Erfassung mehrerer XY-Punkte aus duplizierten oder triplicierten Experimenten die Daten aus separaten, an verschiedenen Tagen durchgeführten Experimenten zusammenstellen und die Datenanalyse sowie statistische Tests gemäß dem schriftlichen Protokoll durchführen, um das Verhältnis von CASP-Bay-negativen zu CASP-Bay-positiven Zellen zu vergleichen. Das Substrat Nuke View 4 88 kann auf eine erhöhte Apoptoserate in N 19 Oligo DDR glialen Zellkulturen hinweisen. Nach einer Behandlung mit hoher extrazellulärer Kaliumkonzentration wurden diese Basislinienbilder mit einem 10-fachen Objektiv aufgenommen.

Die N 19-Zellen wurden mit RFP transfiziert und entweder mit drei Mikrolitern Nuke View, 4 88 Substrat für Kontrollzellen oder mit drei Mikrolitern Nuke View, 4 88 Substrat und 80 Millimolar Kalium behandelt. Diese Bilder zeigen, dass die Anzahl apoptotischer Zellen im Verlauf der Zeit – drei, sechs und neun Stunden nach der Behandlung mit 80 Millimolar Kalium – zunimmt. Unter Kontrollbedingungen wurden im Vergleich zu den mit 80 Millimolar Kalium behandelten Kulturen keine signifikanten Mengen an Apoptose beobachtet. Das im Hintergrund sichtbare grüne Signal unter Kontrollbedingungen weist auf Zellen hin, die Apoptose durchlaufen, ohne dass extrazelluläres Kalium zugegeben wurde.

Ein 12-stündiger Zeitverlauf ist für Studien, die neurologische Schädigungen betreffen, ausreichend. Nach 12 Stunden zeigten die mit Kalium behandelten Kulturen etwa 45 % Zelltod. Praktisch keine der Zellen im Kontrollexperiment zeigt zum 12-Stunden-Zeitpunkt Apoptose. Obwohl in anderen Fällen die Experimente möglicherweise länger durchgeführt werden müssen.

Dieses Diagramm zeigt die Zunahme der Caspase-3-positiven Zellen im zeitlichen Verlauf des zwölfstündigen Experiments. Sobald man mit der Technik vertraut ist, kann sie innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, und die Datenerfassung kann über Nacht erfolgen, sofern alles korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, zwischen den Behandlungsgruppen konsequent zu bleiben, wenn man diesem Protokoll folgt.

Andere Methoden wie die Immunfärbung können verwendet werden, um weitere downstream Proteine zu untersuchen, die in den untersuchten Signalwegen beteiligt sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proben für die Bildgebung vorzubereiten sind. Erfassen Sie einen Datensatz und analysieren Sie Ihre Daten.