Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Lymphknoten von einer anästhesierten Maus chirurgisch zu entfernen. Dies wird erreicht, indem die Lymphknoten zuerst lokalisiert werden. Anschließend werden die Lymphknoten gewonnen und die Inzision wird verschlossen.

Schließlich kann eine Einzelzell-Suspension für die experimentelle Analyse gewonnen werden. Letztendlich können lebensfähige Lymphozytenpopulationen mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die Lokalisation und Entfernung von Lymphknoten angesehen werden müssen, um sie zu beherrschen.

Nachdem die Maus anästhesiert wurde, Augensalbe auftragen, Buprenorphin injizieren und die Sedierung durch Zehenquetschung überprüfen, dann die Maus auf die Seite drehen. Zuerst den brachialen Lymphknoten lokalisieren und anschließend die zu dissezierende Region rasieren. Nachdem lose Haare abgebürstet wurden, die Region mit einem Desinfektionsmittel behandeln und dann einen kleinen Schnitt von etwa fünf Millimetern Länge an der Rückseite des vierbeinigen Beins vornehmen.

Verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um den Schnitt so lange zu dehnen, bis der brachiale Lymphknoten sichtbar ist, der graulich oder dunkler als das umgebende Fett erscheinen kann. Dann zwicken Sie die den Lymphknoten bedeckende Faszie mit einem Pinzettenpaar. Platzieren Sie das zweite Pinzettenpaar so tief wie möglich unterhalb des Lymphknotens und ziehen Sie leicht an der Membran, ohne das umgebende Gewebe zu verletzen.

Verwenden Sie dann das erste Paar Pinzetten, um die Faszie zu durchtrennen und den Lymphknoten zu entfernen. Wenn der Lymphknoten erfolgreich gewonnen wurde, erscheint eine Blutverfärbung an der Stelle, an der sich zuvor der Lymphknoten befand. Legen Sie den entfernten Lymphknoten in eine isotonische Lösung; wenn er sinkt, bestätigt dies, dass das gewonnene Gewebe ein Lymphknoten und kein Fettgewebe ist.

Als Nächstes überprüfen, ob sich keine Haare in der Wunde befinden, und die Inzision schließen, indem man die beiden Innenseiten der Haut zusammenfügt und mit ein bis zwei Klammern verschließt, abhängig von der Größe der Inzision. Danach einen inguinalen Lymphknoten lokalisieren und die zu dissezierende Region rasieren. Nach dem Entfernen eventuell locker sitzender Haare einen Desinfektionsmittel auf die Region auftragen und anschließend einen kleinen Schnitt von etwa fünf Millimetern Länge oberhalb der Hinterpfote in Bauchnähe anlegen.

Nachdem der Schnitt mit zwei Pinzetten, wie zuvor für den brachialen Lymphknoten gezeigt, geöffnet wurde, identifizieren Sie den inguinalen Lymphknoten, der sich in dem umgebenden Fettgewebe befindet. Entfernen Sie anschließend den Lymphknoten mit den beiden Pinzetten, wie gerade demonstriert. Bestätigen Sie erneut die erfolgreiche Entnahme des Lymphknotens, indem Sie die Blutung bemerken, die an der Stelle auftritt, an der sich der Lymphknoten zuvor befand, und geben Sie den inguinalen Lymphknoten danach in einen separaten Behälter mit isotonischer Lösung.

Nachdem alle Lymphknoten entnommen wurden, das Mäuschen in einen Käfig setzen und Nassfutter hinzufügen, damit es leicht fressen kann. Etwa sechs bis acht Stunden nach der Operation das Mäuschen überprüfen, um sicherzustellen, dass es keine Schmerzen hat. Sorgfältig beobachten, ob Haltung, Gangbild, Interaktion mit Artgenossen und das Aussehen des Fells denen einer normalen, gesunden Maus entsprechen.

Schließlich wird der Lymphknoten durch Andrücken gegen mattierte Objektträger in einer Petrischale dissoziiert und anschließend in ein Reagenzglas überführt, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Nach der Färbung der Zellen für die gewünschten Oberflächenantigene werden diese mittels Durchflusszytometrie analysiert. Hier sind beispielhafte Vorwärts- und Seitenstreu-Diagramme für Lymphknoten dargestellt, die von entweder anästhesierten oder getöteten Tieren gewonnen wurden.

Die Profile und Prozentsätze der Zellen in den lebenden Lymphozyten-Toren der beiden Streudiagramme sind identisch. Dies zeigt, dass die Lymphknotenchirurgie eine geeignete Technik zur Gewinnung von Zellen ist. Sobald die Lymphknotenchirurgie beherrscht ist, kann sie pro Maus in fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden, sofern sie korrekt ausgeführt wird.