Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung angelegter elektrischer Felder auf die Migration von neuronalen Vorläuferzellen in 2D-Kulturen und 3D-ex vivo-Modellen aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zuerst neuronale Vorläuferzellen in vitro isoliert und expandiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine Einzelzell-Suspension aus neuronalen Vorläuferzellen herzustellen.

Anschließend werden für die Vorbereitung der 2D-Kultur neurale Vorläuferzellen in speziell konzipierten elektrischen Taxis-Kammern ausgesät. Alternativ werden für die Vorbereitung des 3D-ex-vivo-Modells neurale Vorläuferzellen mit Haken 3, 3, 3, 4, 2 markiert und in ein organspezifisches Schnittmodell des Rückenmarks injiziert. Schließlich wird ein elektrisches Feld auf die Elektrokammern angewendet, und eine Zeitrafferaufnahme wird durchgeführt, um zu zeigen, dass sich die Vorläuferzellen in sowohl 2D- als auch 3D-Umgebungen in Richtung der Kathode des elektrischen Feldes bewegen.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine neuartige Methode zur Live-Verfolgung der elektrischen Feld-induzierten Migration einzelner Zellen nach deren Transplantation in ein 3D-organotypisches Modell bietet, das der natürlichen Umgebung stark ähnelt. Diese Methode kann nicht nur Einblicke in die Elektrotechnik und die Migration von neuralen Zellen gewähren, die in Schnittpräparate des Rückenmarks transplantiert wurden, sondern lässt sich auch auf andere Systeme anwenden, wie beispielsweise kleine Gehirnschnittmodelle. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie 22 mal 11 Millimeter große Glasstreifen vor, indem Sie das Autoklav 22 mal 22 Millimeter teilen.

Teilen Sie Deckgläser der Nummer eins mit einem Diamantschreiber zur Hälfte. Erstellen Sie anschließend eine freistehende Glaswanne mit inneren Abmessungen von 22 mal 10 Millimetern, indem Sie vier senkrecht stehende Streifen der Größe 22 mal 11 Millimeter mit hochvakuumtauglichem Silikonfett miteinander verkleben. Lassen Sie die Wanne über Nacht vollständig trocknen und aushärten. Am nächsten Tag befestigen Sie zwei Glasstreifen der Größe 22 mal 11 Millimeter parallel zueinander mit einem Abstand von 10 Millimetern auf dem Boden einer 100-Millimeter-Kulturschale unter Verwendung von Silikonfett.

Dann versiegeln Sie den Bereich zwischen diesen Streifen, indem Sie einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckgläser mit Silikonfett befestigen. Stellen Sie das Glasgefäß auf die Deckgläser, sodass die Innenwände einen begrenzten Raum für die Zellansaat bilden. Dichten Sie alle Verbindungsstellen wasserdicht mit Silikonfett ab.

Überziehen Sie diesen begrenzten Bereich nacheinander mit Poly-D-Lysin und anschließend mit Laminin, wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben. Gewinnen Sie in diesem Verfahren die Gehirne von Mäusen im Zeitraum E14 bis E16 und legen Sie sie in kaltes D-MEM-F12-Grundmedium. Entfernen Sie danach die Hirnhäute unter einem anatomischen Mikroskop.

Anschließend überführen Sie die Gehirne in eine 35-Millimeter-Petri-Schale. Zerlegen Sie die Gehirne mit feinen Pinzetten in Gewebefragmente. Danach überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 800 U/min für drei Minuten, um A-Trümmer zu entfernen. Danach A-D-M-E-M-F 12 mit BFDF und DGF zu den Proben geben. Vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette ansetzen und mischen.

Dann gewinnen Sie die Einzelzell-Suspension mithilfe eines Zellfilters. Impfen Sie die Zellen in die Kolben mit 20.000 bis 50.000 Zellen pro Milliliter aus. Führen Sie anschließend alle drei Tage einen kompletten Mediumwechsel durch, bei dem die Zellen fünf Minuten lang bei 1.300 U/min zentrifugiert werden.

Entfernen Sie das Überstand-Medium, suspendieren Sie den PT in frischem Medium und geben Sie die Zellen alle sechs Tage nach mindestens fünf Tagen erneut in den Kolben zurück. Überführen Sie die NEUROSPHÄREN in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.500 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet erneut in EDTA, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Bereiten Sie vor der Zellzählung ein Milliliter Suspension mit 10.000 Zellen vor. Entfernen Sie anschließend Laminin aus der Glasvertiefung und lassen Sie diese vollständig trocknen.

Ersetzen Sie es durch ein Milliliter Zellsuspension. Danach stellen Sie die Schale für mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius in den Inkubator, um die Anheftung zu ermöglichen. Sobald die Zellen ausreichend konfluent sind, entfernen Sie das Medium aus der Kammer.

Entfernen Sie vorsichtig das Glas. Bilden Sie dann einen Überzug über die Zellen, indem Sie einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckglaskörper mit Hilfe von Silikonfett vorsichtig zwischen zwei 22 mal 11 Millimeter große Streifen befestigen. Denken Sie daran, die Zellen mit einigen Tropfen Medium zu bedecken, um Austrocknung zu vermeiden.

Bilden Sie dann an jedem Ende der Kammer ein isoliertes Mediumreservoir, indem Sie zwei wasserdichte Barrieren aus Silikonfett anlegen, die von einem Ende der Schale zum anderen reichen. Füllen Sie die Kammer mit frischem Medium und sorgen Sie dafür, dass ein Durchfluss von einem Mediumreservoir zum anderen entsteht. Anschließend stellen Sie die Schale für 12 Stunden in den Inkubator, um die Zellen regenerieren zu lassen.

Bereiten Sie im nächsten Schritt einen Deckel zur Abdeckung der Schale vor, indem Sie zwei Löcher bohren, wobei sich jedes Loch über einem Reservoir der Migrationskammer befindet. Danach ersetzen Sie das Medium in der Kammer durch kultiviertes Medium, das 25 Millimeter Hippies-Puffer enthält. Anschließend überführen Sie die Schale in das temperaturgesteuerte Abbildungssystem.

Stellen Sie die experimentellen Parameter für die Zeitrafferaufnahme und die Mehrpositionsaufnahme ein. Richten Sie die Kammer so aus, dass die Kathode links und die Anode rechts liegt, um sicherzustellen, dass der elektrische Feldvektor horizontal verläuft, wie unter dem Mikroskop sichtbar und im Abbildungssystem aufgezeichnet. Füllen Sie anschließend zwei Bechergläser.

Mit Steinbergs Lösung. Verbinden Sie einen separaten Becher mit jedem Mediumreservoir unter Verwendung der vorbereiteten Glasbrücken, die mit einer 2 %igen Steinbergs Agar-Lösung gefüllt sind. Dann bringen Sie die mit einer Gleichstromquelle verbundenen Silberelektroden in die Steinberg-Lösung ein.

Stellen Sie an jedem Becher das Spannungsregler am Netzteil auf null ein und schalten Sie es ein. Messen Sie die Spannung über der Elektrotaxis-Kammer mit einem Spannungsmessgerät, während Sie den Spannungsregler hochdrehen. Anschließend stellen Sie die Spannung gemäß den experimentellen Anforderungen ein.

Danach die Zeitrafferaufnahme starten. Bei Bedarf Medium wechseln und die Spannung erneut einstellen. Stündlich können frische Medien, Wirkstoffe oder chemische Substanzen je nach Bedarf den Reservoirs hinzugefügt werden.

Unter Verwendung zusätzlicher Löcher, die in den Deckel der Kulturschale gebohrt wurden, wobei sich jeweils eines über jedem Mediumreservoir befindet. In diesem Schritt dissezieren Sie die lumbalen Rückenmarkstücke von zweiwöchigen Mäusen. Anschließend schneiden Sie die Rückenmarkstücke unter einem anatomischen Mikroskop mit einem Machel-Wane-Gewebeschneider in 500 Mikrometer dicke Schnitte.

Trennen Sie die Schnitte und wählen Sie diejenigen mit intakter sagittaler axialer Rückenmarksstruktur aus. Anschließend geben Sie die Schnitte in eine 100 Millimeter große Petrischale, die 30 Mikroliter MA-Gel enthält. Platzieren Sie sie so nah wie möglich am Zentrum.

Sie in einem 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius mindestens 30 Minuten lang inkubieren. Damit die Matri-Gel-Proteine sich selbst zu einer dünnen Schicht zusammenlagern können, die die Oberfläche der Schnittpräparate des Rückenmarks bedeckt, ist es sehr wichtig, dass die Matri-Gel-Vernetzung vollständig abgeschlossen ist. Gegebenenfalls die Petrischale weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, dann vier bis sechs Milliliter D-MEM/F12-Medium, das 25 Millimolar HEPES-Puffer und 15 bis 20 % Fötales Kälberserum enthält, hinzufügen.

Sehr vorsichtig, um zu vermeiden, dass das Medium direkt auf die Schnitte fließt, sicherstellen, dass die Schnitte nicht vollständig im Medium eingetaucht sind, sodass die Oberfläche der Auberginen gut der Luft ausgesetzt bleibt. Das Medium zweimal wöchentlich wechseln. Nun die Suspension der neuronalen Vorläuferzellen in dem Medium mit fünf Mikromolar Hooks inkubieren.

3, 3, 3, 4, 2 für 30 Minuten. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Kapillarglaskolben, um zwei Mikroliter der Suspension in den Rückenmarkschnitt einzuspritzen. Achten Sie darauf, dass die Kapillarglaskolbe langsam durch das Matrigel hindurchgeht und in das Innere des Rückenmarkschnitts vordringt.

Halten Sie das Glasröhrchen mindestens 30 Sekunden lang in der Rückenmarkscheibe, um eine Zellsuspension zu vermeiden. Überfahren Sie es anschließend und stellen Sie die Petrischale mit der Rückenmarkscheibe über Nacht in den Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid. Am nächsten Tag bauen Sie eine elektrotaktische Kammer um die Rückenmarkscheibe herum auf, die Haken mit 3 3 3 4 2 markierten Neurogenese-Zellen enthält, bevor Sie ein elektrisches Feld mit einer Stärke von 500 Millivolt pro Millimeter anlegen.

Hier zeigen die neuronalen Vorläuferzellen eine stark gerichtete Migration in Richtung der Kathode, wenn sie elektrischen Feldern ausgesetzt werden; rote Linien und blaue Pfeile stellen jeweils die Trajektorien und die Richtung der Zellbewegung dar. Und hier ist die Darstellung der gezeigten Migrationspfade. Hier sind die neuronalen Vorläuferzellen markiert mit Hooks 3 3, 3, 4 2.

Sie wurden zum Beginn der elektrischen Feldbehandlung in die organspezifischen Schnitte des Rückenmarks transplantiert. Nachdem sich die neuronalen Vorläuferzellen 2,5 Stunden lang gezielt in Richtung der Kathode bewegt hatten, wurde die Polarität des elektrischen Feldes umgekehrt. Die geänderte Polarität des elektrischen Feldes löste eine deutliche Umkehrung der Axonrichtung in Richtung der neuen Kathode aus.

Hier ist ein Bild der transplantierten neuronalen Vorläuferzellen im Schnitt des Rückenmarks. Am Ende der Zeitrafferaufnahme wird eine 3D-Rekonstruktion der transplantierten neuronalen Vorläuferzellen im Schnitt des Rückenmarks gezeigt. Masse gemeistert.

Diese Technik kann innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, sofern sie nach ihrer Entwicklung ordnungsgemäß angewendet wird. Die Technik ebnet nun Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, um die Migration neuraler Vorläuferzellen in 2D- und 3D-Kultursystemen in Reaktion auf und unter Anwendung elektrischer Felder zu untersuchen.