Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mikroregionale Gewebehypoxie im Maus-Kortex in vivo direkt zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein offenes Schädel-Fenster an einer anästhesierten Maus präpariert wird. Anschließend wird ein fluoreszierender Farbstoff intravenös injiziert, um die zerebralen Blutgefäße zu markieren.

Schließlich erfolgt gleichzeitig die Photonenaufnahme der intrinsischen NADH-Fluoreszenz und der fluoreszenzmarkierten kortikalen Mikrozirkulation. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die funktionelle Hypoxie in mikroskopisch kleinen Bereichen des Hirnparenchyms durch die Visualisierung der reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Clark-Elektroden besteht darin, dass sie eine hohe räumliche Auflösung über ein großes Sichtfeld bietet und zudem weniger invasiv ist.

Dieses Verfahren kann an einem standardmäßigen zweikanaligen Fluoreszenz-Imaging-System mit zwei fluoreszierenden Kanälen durchgeführt werden. Hallo, ich bin Steve Hurst, Professor und Leiter der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie an der University of Rochester. Die heutige Demonstration wird von Anitas Sohn aus dem Kishka-Labor sowie von Oxana Paulka, einer wissenschaftlichen Assistentin aus meinem Labor, durchgeführt. Dr. Kishka, der die NADH-Bildgebungstechnik maßgeblich entwickelt hat, kann heute leider nicht anwesend sein, da er kürzlich nach Deutschland gezogen ist. Nachdem der Operationsbereich mit den notwendigen Instrumenten vorbereitet wurde, die entweder im Autoklaven sterilisiert oder mit 70 %igem Ethanol desinfiziert wurden, und die Maus mit 5 % Isofluran narkotisiert wurde, platzieren Sie das Tier auf einer Heizplatte und legen eine Gesichtsmaske an, um 1,3 bis 1,5 % Isofluran in Luft zuzuführen.

Überprüfen Sie den Anästhesiegrad durch eine Schwanzquetschung. Führen Sie anschließend eine rektale Sonde ein und messen Sie kontinuierlich die Körpertemperatur des Tieres während des gesamten Verfahrens. Tragen Sie künstliches Tränen-Gel auf die Augen der Maus auf, um Austrocknung zu verhindern.

Entfernen Sie dann die Haare vom Kopf und tragen Sie an beiden Oberschenkeln zwei Minuten lang Enthaarungsmittel auf, um die restlichen Haare zu entfernen; der Oberschenkel wird für die Oximetrie verwendet. Desinfizieren Sie abschließend die Kopfhaut mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung und 70%igem Ethanol. Um ein Schädel Fenster anzulegen, beginnen Sie fünf Millimeter vom Schädel entfernt und schneiden Sie mit der Schere.

Führen Sie einen Schnitt in die Kopfhaut ein und führen Sie ihn um einen Zentimeter fort. Bewegen Sie die Haut zur Seite, um den Schädel freizulegen, um die Membranen auf der Oberseite des Schädels zu entfernen. Tragen Sie eine 10%ige Eisen(III)-chlorid-Lösung auf.

Wischen Sie die überschüssige Lösung ab und kratzen Sie die Membranen in einem Winkel von 45 Grad ab. Nummer fünf, Pinzette: Identifizieren Sie mithilfe eines Stereomikroskops den Bereich von Interesse. Tragen Sie eine dünne Schicht Schnellkleber um die Ränder des Fensters der Kopfplatte auf.

Platzieren Sie die Kopfplatte so, dass der interessierende Bereich im Fenster freiliegt, und üben Sie leichten Druck auf die Kopfplatte aus. Geben Sie eine kleine Menge Zahnzement auf, um den Klebstoff schnell zu polymerisieren. Halten Sie den Druck während der Polymerisation des Klebstoffs 10 Sekunden lang aufrecht.

Tragen Sie eine kleine Menge Schnellkleber auf die Ränder des Fensters auf, um die Kopfplatte mit dem Schädel zu verbinden. Schrauben Sie anschließend die Kopfplatte unter dem Präparationsmikroskop am Tierhalter fest. Verwenden Sie dazu das Mikrodrehmoment-Bohrgerät, eingestellt auf 6.000 U/min, und den Bohrer IRF 0 0 5.

Entfernen Sie jeglichen überschüssigen Kleber vom Schädel und von der Kopfplatte. Stellen Sie dann den Bohrer auf tausend Umdrehungen pro Minute ein und beginnen Sie, den Schädel zu bohren, indem Sie einen Kreis innerhalb des Fensters der Kopfplatte mit einem Durchmesser von etwa fünf Millimetern erzeugen. Verwenden Sie dabei leichte, fegende Bewegungen, als würden Sie mit einem sehr weichen Bleistift zeichnen.

Unterbrechen Sie das Bohren alle 20 bis 30 Sekunden und verwenden Sie Druckluft, um Knochendust zu entfernen. Während des Bohrvorgangs bildet sich ein Graben um den intakten Schädel in der Mitte herum. Achten Sie darauf, nicht durch den dünnen Schädel zu stechen, sondern sicherzustellen, dass dieser Graben eine gleichmäßige Dicke aufweist.

Seien Sie außerdem besonders vorsichtig in der Nähe großer Blutgefäße. Diese sollten nicht beeinträchtigt werden und, wenn möglich, nicht einmal berührt werden. Heben Sie mit einer Spitze einer Pinzette den Knochen in der Mitte des Fensters an und geben Sie einen Tropfen künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit auf das Fenster. Wischen Sie vorsichtig mit der Ecke eines Kim-Tuchs die künstliche zerebrospinale Flüssigkeit in einem Winkel von 45 Grad ab.

Punkt fünf, Pinzette. Suchen Sie einen Bereich der beschädigten Dura entlang des Fensterrandes, heben Sie sie an und entfernen Sie sie. Falls Blutungen auftreten, geben Sie einen Tropfen künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) auf und warten Sie zwei bis drei Minuten, bis geringfügige Blutungen zum Stillstand kommen.

Bereiten Sie als Nächstes 10 Milliliter einer 0,07 %igen Low-Melting-Agarose-Lösung in künstlichem zerebrospinalen Fluid vor. Erwärmen Sie die geschmolzene Agarose auf Körpertemperatur. Entfernen Sie das überschüssige künstliche zerebrospinale Fluid von der Oberfläche des Gehirns.

Geben Sie das Aeros in das Fenster und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Drücken Sie dann vorsichtig auf das Glas, um den Kontakt zwischen dem Glas und der Kopfplatte herzustellen, und warten Sie 10 bis 20 Sekunden, bis das Aeros fest wird. Entfernen Sie mithilfe von Pinzette und weichem Papiertuch überschüssiges Aeros vom Deckglas.

Geben Sie eine kleine Menge Schnellkleber rund um das Glas, um es an der Kopfplatte zu befestigen. Tragen Sie anschließend eine kleine Menge Zahnzement auf, um den Kleber zu verfestigen, bevor Sie in die Vena femoralis injizieren. Drehen Sie das Tier teilweise um, um die Innenseite des linken Oberschenkels freizulegen.

Fixieren Sie das Tier mit Klebeband. Tragen Sie in dieser Position einen antiseptischen Abwasch und anschließend hundertprozentigen Ethanol auf die Haut auf. Danach führen Sie einen Schnitt entlang der medialen Oberschenkelregion vom Knie bis zur Schambeinfuge durch.

Falls erforderlich, trennen Sie die Weichteile durch stumpfe Dissektion. Befüllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 130 Mikrolitern Texas Red. Setzen Sie eine neue 30-Gauge-Nadel auf und biegen Sie sie vorsichtig um 30 Grad, wobei die Schräge nach oben bleibt.

Füllen Sie die Nadel unter einem Stereomikroskop mit der Texas-Red-Lösung, führen Sie die Nadel in die Arteria femoralis ein und injizieren Sie hundert Mikroliter Texas Red. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie leicht mit einer Gazekompresse auf die Ader, um die Blutung zu stillen. Verschließen Sie die Haut mit einer 4-0-Naht, um eine kontinuierliche Überwachung der Blutsauerstoffsättigung zu ermöglichen.

Platzieren Sie die Oximeter-Sonde am rechten Oberschenkel, an dem zuvor die Haare entfernt wurden. Um mit der Bildgebung zu beginnen, bringen Sie die chirurgisch vorbereitete Maus auf den Mikroskopständer. Machen Sie ein erstes Bild der kranialen Fensterstelle mit Hellfeldbeleuchtung bei vierfacher Vergrößerung, um es als Referenzkarte für die Registrierung mit höherer Vergrößerung zur Photonanierung zu verwenden.

Vergrößern Sie den Bereich von Interesse mit 10-facher Vergrößerung. Wählen Sie einen Bereich von Interesse in den kortikalen Schichten aus. Beginnen Sie mit der Aufnahme der Zeitreihe mit einem oder zwei.

Wir empfehlen die Verwendung eines Durchschnitts von drei bis fünf Bildern, um die Bildqualität zu verbessern. Induzieren Sie anschließend eine Hypoxämie, indem Sie 50 % Stickstoff zu der Luft hinzufügen, die das Tier einatmet. Dadurch wird der Sauerstoffgehalt auf 10 % gesenkt. Überprüfen Sie die Hypoxämie durch die Überwachung der Oximeterdaten.

Setzen Sie die Erfassung der Zeitreihe während der Hypoxämie für etwa 30 Sekunden und danach bis zur Wiederherstellung des normalen Sauerstoffniveaus fort. Sammeln Sie Daten zur Berechnung der Sauerstoffverteilung, indem Sie den Bereich der Hypoxie und der sauerstoffreichen Gewebezylinder um die Blutgefäße detektieren, messen und quantifizieren. Um den Radius R des sauerstoffreichen Gewebezylinders zu bestimmen, messen Sie den Abstand zwischen dem Mittelpunkt des Blutgefäßes und der Grenze, an der hohe NADH-Fluoreszenz detektiert wird.

Beziehen Sie sich auf das schriftliche Protokoll für die Methoden der Datenverarbeitung. Diese Abbildung zeigt gleichzeitige NADH- und Geographiebilder aus einem Video, das während einer vorübergehenden Hypoxämie aufgezeichnet wurde, bei der die inspirierte Sauerstoffkonzentration für einen Zeitraum von drei Minuten von 21 % auf 10 % gesenkt wurde. Dieses Ausmaß einer experimentell induzierten Hypoxämie ist ausreichend, um eine schwere Hypoxie in der Großhirnrinde hervorzurufen.

Die Hypoxie führte zu einer Zunahme der NADH-Fluoreszenz, die anfangs grün in den Bereichen am weitesten entfernt von der arteriellen Blutversorgung sichtbar war. Beachten Sie die scharfen NADH-Gewebegrenzen, die die beobachtbaren Gewebegrenzen der Sauerstoffdiffusion aus der kortikalen Mikrozirkulation darstellen, die rot dargestellt ist. Hier ist ein gleichzeitiges Bild der fluoreszenzmarkierten Mikrogefäße der Hirnrinde in rot und der intrinsischen NADH-Fluoreszenz aus der grauen Substanz der Hirnrinde in grün; die Intensitätsverteilung der NADH-Fluoreszenz ist binär.

Es gibt Bereiche mit einheitlich niedriger NADH-Fluoreszenz und Bereiche mit einheitlich hoher NADH-Fluoreszenz. Die gelben Linien stellen die Gewebegrenzen zwischen den Bereichen mit niedriger und hoher NADH-Fluoreszenz dar. Diese Gewebegrenzen weisen eine räumliche Beziehung zu den benachbarten Mikrogefäßen auf.

Diese Beziehung wird durch die Sauerstoffdiffusion von den Mikrogefäßen in das Gewebe bestimmt. In einigen Fällen kann die zylindrische Struktur oder der CRO-Gewebeszylinder dieser Gewebegrenzen direkt erkannt werden, wie durch die blauen Linien angezeigt. Hier weist die Gewebegrenze eine kreisförmige Form mit einem konzentrisch liegenden zentralen Blutgefäß auf, sobald dies beherrscht ist.

Diese Technik kann in 1,5 Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Deckglas auf der Metallplatte zu befestigen, um vertikale Bewegungen der kortikalen Oberfläche aufgrund von Ödemen zu verhindern. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Messungen der funktionellen Hyperämie mit dem Ziel, weitere Fragestellungen zu klären, etwa den Zusammenhang zwischen Gewebehypoxie und zerebrovaskulärer Kopplung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mikroregionale Gewebehypoxie in der Mausenhirnrinde sichtbar machen kann.