Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

Dieses experimentelle System zielt darauf ab, den Beitrag spezifischer Proteine an dem invasiven Prozess zu charakterisieren. Beginnen Sie mit der retroviralen Transduktion von Zellen mit dem fluoreszierenden Protein der Untersuchung. Erstellen Sie außerdem die dreidimensionale Matrix aus Matrigel-Protein in Transwell-Einsätzen und bereiten Sie eine Zellsuspension in der geeigneten Verdünnung vor.

Mithilfe des Matrigel-Transwell-Systems wird die Transmigrationsreaktion auf das Chemoattractans unter Zugabe von Testsubstanzen oder Behandlungen gemessen, um anschließend die Zellinvasion mittels konfokaler Mikroskopie zu visualisieren und zu analysieren. Letztendlich können so Ausmaß und Art der Zellinvasion in eine dreidimensionale Proteinmatrix bestimmt werden. Die Stärke dieser Methode im Vergleich zu etablierten Verfahren wie dem klassischen Transwell-Invasionsassay liegt in ihrer Fähigkeit, sowohl quantitative als auch qualitative Daten zur Zellinvasion in eine dreidimensionale Proteinmatrix bereitzustellen.

Meine Kollegin, Diane Creighton, wird nun die Methode demonstrieren: Kultivieren Sie retrovirale Verpackungszellen in DMEM mit 10 % FBS für 48 Stunden. Transfizieren Sie die Zellen mit retroviraler DNA gemäß den Herstelleranweisungen. Inkubieren Sie 24 Stunden lang, spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit Medium aus und geben Sie anschließend 1,5 Milliliter 10 % FBS-DMEM pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie weitere 48 Stunden, um das verpackte Retrovirus zu sammeln.

Überführen Sie das Zellkulturmedium in 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie, um eventuelle Zellen zu pelletieren, und gewinnen Sie das Überstand in ein sauberes Röhrchen. Lagern Sie diesen Retrovirus-Stammsatz bei minus 80 Grad Celsius. Entfernen Sie nun das Medium aus einer Übernachtkultur von retrotransduzierten Zellen und geben Sie ein Milliliter Retrovirus-Stammsatz, ergänzt mit Polygreen, hinzu.

Nach einer sechsstündigen Inkubation zwei Milliliter 10 % FBS-DMEM in die Vertiefung geben und die Platten in einen 37 °C warmen Inkubator stellen. Über Nacht das Medium erneuern und nach 24 Stunden, sobald Konfluenz erreicht ist, das geeignete selektive Medium zugeben, die Zellen ernten und bezüglich der Fluoreszenz unter Verwendung nicht transduzierter Zellen als Referenz sortieren. Zellen mit einer höheren Fluoreszenz als die nicht transduzierten Zellen sammeln und Aliquots bei −80 °C für die spätere Verwendung einfrieren.

Diese Methode beruht auf der Expression fluoreszierender Proteine zur Visualisierung und ermöglicht Einblicke in die Beiträge einzelner Zellen. Dann das komplette Matrigel auf Eis auftauen und im Anschluss im Verhältnis 1:1 mit eiskaltem PBS verdünnen. Danach die unbehandelten Transwells in eine 24-Loch-Gewebekulturplatte einsetzen.

Danach vorsichtig 100 Mikroliter verdünntes Matri-Gel in die Vertiefungen pipettieren und bei 37 Grad Celsius verfestigen lassen. In der Zwischenzeit die fluoreszenzmarkierten Zellsuspensionen in ihrem normalen Wachstumsmedium vorbereiten. Sobald das Matri-Gel erstarrt ist, die Transwell-Kammern umdrehen und 100 Mikroliter der Zellsuspension auf die dem Ausgang zugewandte Unterseite des Filters pipettieren.

Decken Sie die Transwell vorsichtig mit der Unterseite einer 24-Loch-Gewebekulturplatte ab, wobei jeder Tropfen der Zellsuspension berührt wird. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang im umgekehrten Zustand, um die Zellanheftung zu ermöglichen. Drehen Sie die Platten nun wieder in die normale Position und waschen Sie jedes Transwell, indem Sie es zweimal in je ein Milliliter serumfreies Medium eintauchen.

Danach den Transwell in eine dritte Vertiefung bringen, die Arzneimittel oder Behandlungsreagenzien enthält. Vorsichtig 100 Mikroliter Medium mit Chemoattraktans über der erstarrten Matrigel-PBS-Mischung in den Transwell pipettieren. Für drei bis fünf Tage bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren, um nichtfluoreszierende Zellen zu bildmäßig erfassen, während sie in Matrigel eindringen.

Transwells in frische 24-Loch-Platten geben und pipettieren. Ein Milliliter vier Mikromolar Calcium-AM-Lösung auf jeden Matri-Gel-Plug geben, sodass sie über die Seiten läuft und den Plug von oben und unten anfärbt. Eine Stunde bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Anschließend mittels konfokaler Mikroskopie abbilden.

Diese erste lebende Färbemethode ermöglicht die Visualisierung von Invasionstypen. Überführen Sie jeden Transwell in eine neue 24-Loch-Platte, geben Sie einen Milliliter 4 % Paraformaldehyd mit 0,2 % Triton X-100 hinzu und inkubieren Sie eine halbe Stunde bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Waschen mit jeweils einem Milliliter PBS fügen Sie RNase A für 30 Minuten hinzu, waschen anschließend zweimal mit PBS und führen die Visualisierung mit 0,01 Milligramm pro Milliliter durch.

Propidiumiodid in PBS verdünnen und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln belassen. Dreimal mit PBS waschen. Zu diesem Zeitpunkt können die mit Propidiumiodid gefärbten Transwell-Kammern mindestens einen Monat lang bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt werden.

Die zweite Zellfärbemethode erfordert eine Fixierung, ermöglicht jedoch eine schnellere Quantifizierung der Invasion. Platziere mit einem invertierten konfokalen Mikroskop den Transwell mit einer geringen Menge restlichem PBS auf eine große Deckglasplatte über ein Objektiv mit 20-facher Vergrößerung ohne Immersionsflüssigkeit und erfasse optische Schnitte in Abständen von jeweils 10 bis 15 Mikrometern, ausgehend vom Boden des Matrigel-Plugs. Quantifiziere das Ausmaß der Invasion anhand einzelner optischer Schnittbilder. Erstelle außerdem dreidimensionale Objekte mithilfe geeigneter Software wie Velocity aus dieser Serie optischer Schnitte, wobei die Zellen mit Calciumam gefärbt wurden.

Wie erwartet nimmt die Anzahl der Zellen, die durch den Filter eindringen, mit zunehmender Distanz ab. Dieses Eindringen kann quantifiziert werden. Dreidimensionale Rekonstruktionen des Zelleindringens bieten eine visuelle Darstellung der Eindringungsart.

Wenn Zellen durch die Expression fluoreszierender Proteine markiert sind, können die Positionen der Zellen jeder Farbe in dreidimensionalen Rekonstruktionen wie in dieser Seitenansicht dargestellt werden. Zusätzlich können Schnitte durch die Rekonstruktion Einblicke in molekulare Mechanismen bieten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dieser Zellinvasionsassay genutzt werden kann, um mehr Informationen über den Ausweichprozess zu erhalten, als mit den Standardmethoden möglich ist.