Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch ¹³ C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Das Ziel dieses Protokolls besteht darin, den bakteriellen Stoffwechsel mithilfe einer Kohlenstoff-13-unterstützten Stoffwechselanalyse zu untersuchen. Zunächst werden Mikroben in Gegenwart markierter Kohlenstoffsubstrate kultiviert, die in die mikrobiellen Proteine eingebaut werden. Anschließend werden die Mikroben geerntet, und Aminosäuren werden extrahiert, hydrolysiert und derivatisiert.

Die Proben werden einem Gaschromatographen und Massenspektrometer oder GCMS zugeführt. Durch die Verfolgung der Atomübergangspfade zwischen Metaboliten im biochemischen Netzwerk können die funktionell aktiven Stoffwechselwege ermittelt werden, die vom Mikroorganismus genutzt werden. Ich bin Bert Burla.

Die hier vorgestellte Methode kann als Ergänzung zu Transkriptomik und Proteomik zur Bestimmung der Stoffwechselwege in Mikroben verwendet werden. Mithilfe dieser Technik haben wir photosynthetische Mikroben wie Cyanobakterien hinsichtlich ihrer autotrophen oder heterotrophen Kohlenstoffnutzung untersucht. In diesem Video verwenden wir ANOTHE 5 1 1 42 als Modellstamm, um den Einsatz markierter Kohlenstoffsubstrate zur Entdeckung neuer enzymatischer Funktionen zu demonstrieren.

Den Ablauf werden ich selbst, li Yu und Chu Yang Fang demonstrieren. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie Cyana thesei-Bakterien in einem nicht markierten Medium kultivieren. Wenn die Bakterien die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht haben, impfen Sie 3 % des Volumens in das mit Kohlenstoff-13 markierte Medium.

Danach, um die Einführung von nicht markiertem Kohlenstoff aus der anfänglichen Inokulum-Subkultur in dasselbe markierte Medium während der mittleren log-Phase zu vermeiden. Wenn die mit Kohlenstoff-13 markierten Cy Thesei-Bakterien die mittlere log-Wachstumsphase erreicht haben, 10 Milliliter durch Zentrifugation gewinnen. Den Pellet in 1,5 Milliliter sechsmolarer Salzsäure resuspendieren und in ein klares Glas-Schraubverschluss-Gaschromatographie- oder GC-Gefäß überführen.

Schließen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie 24 Stunden lang in einen Ofen bei 100 Grad Celsius, um die Biomasseproteine in Aminosäuren zu hydrolysieren. Die Hydrolyse von Biomassepellets ergibt 16 der 20 üblichen Aminosäuren. Überführen Sie die Aminosäurelösung in 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 20.000 × g. Nach der Hydrolyse überführen Sie die Aminosäurelösung in 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren fünf Minuten bei 20.000 × g, um feste Partikel abzutrennen.

Nach dem Zentrifugieren die Überstände in neue GC-Gefäße überführen, um feste Partikel aus der Hydrolyselösung zu entfernen, damit sie nicht in die GC-Säule gelangen. Anschließend werden die Aminosäuren derivatisiert, um sie flüchtig für die Trennung mittels Gaschromatographie zu machen. Lösen Sie die getrockneten Proben mit 150 µL Tetrahydrofuran, THF, und 150 µL tert-Butyl-dimethylsilo und Methyltrifluoracetat.

Acetamid, T-B-D-M-S-Derivatisierungsreagenz: Inkubieren Sie alle Proben eine Stunde lang in einem Ofen bei 65 bis 80 Grad Celsius. Wirbeln Sie die Proben gelegentlich, um sicherzustellen, dass die Metaboliten im Gefäß gelöst sind. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 ×g für 10 Minuten und überführen Sie danach den Überstand in neue GC-Gefäße.

Das Überstand sollte eine klare, gelbliche Lösung sein. Die GC-Temperaturen wie folgt: zweimal bei 150 Grad Celsius halten. Mit drei Grad Celsius pro Minute auf 280 Grad Celsius erhöhen.

Erhöhen Sie die Temperatur um 20 Grad Celsius pro Minute auf 300 Grad Celsius und halten Sie diese dann fünf Minuten lang konstant. Stellen Sie anschließend bei einer 30 Meter langen GC-Säule die Lösungsmittelverzögerung auf etwa fünf Minuten ein und den Bereich des Massen-zu-Ladungs-Verhältnisses zwischen 60 und 500. Analysieren Sie die Proben mittels GC-MS mit einem Split-Verhältnis von eins zu fünf oder eins zu 10, einem Injektionsvolumen von einem Mikroliter und einem Trägergas Helium mit einer Flussrate von 1,2 Millilitern pro Minute im Anschluss an den Lauf.

Analysieren Sie die GC-MS-Daten mithilfe von Microsoft Excel. Die Retentionszeit in der Gaschromatographie und die charakteristischen Massen-zu-Ladungs-Verhältnis-Peaks für jede Aminosäure sind in dieser Abbildung dargestellt. T-B-D-M-S. Derivatisierte Aminosäuren werden normalerweise von der Massenspektrometrie eindeutig in zwei geladene Fragmente gespalten: Fragment M minus 57, das die gesamte Aminosäure enthält, und Fragment M minus 159, das die α-Carboxylgruppe der Aminosäure fehlt; dies gilt für Leucin und Isoleucin.

Der M minus 57 Peak überlappte sich mit anderen Massenpeak-Fragmenten. N minus 15 kann zur Analyse der gesamten Aminosäuremarkierung verwendet werden. Außerdem wird die F 3 0 2-Gruppe häufig in den meisten Aminosäuren nachgewiesen und enthält nur die erste alpha-Carboxylgruppe und die zweiten Kohlenstoffatome im Aminosäure-Rückgrat.

Jedoch wird F 3 0 2 aufgrund des häufig hohen Rauschens im Verhältnis zum Signal nicht zur quantitativen Analyse metabolischer Flüsse empfohlen. Die Derivatisierung von Aminosäuren oder zentralen Metaboliten führt zu erheblichen Mengen natürlich vorkommender markierter Isotope, einschließlich Kohlenstoff-13, Sauerstoff-18, Silizium-29 und Silizium-30. Das Messrauschen durch natürliche Isotope in der rohen Massenisotop- oder Spektrumsanalyse kann mithilfe veröffentlichter Software korrigiert werden.

Die endgültigen Daten zur isotopischen Markierung werden als Massenanteile angegeben. Beispielsweise M null, M1, M zwei, M drei und M vier, die Fragmente mit null bis vier mit Kohlenstoff-13 markierten Kohlenstoffatomen darstellen. Dieses 5 1 1 2 enthält nicht das Enzym Threonin-Ammoniak-Lyase, das im typischen Isoleucin-Syntheseweg die Umwandlung von Threonin zu 2-Keto-Butyrat katalysiert.

Daher wurde Cyana THESEI 5 1 1 42 in ASP2-Medium mit 54 Millimolar Glycerin kultiviert und wie in diesem Video beschrieben mittels GC-MS analysiert, wie hier gezeigt. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 nutzt am zweiten Position markiertes Glycerin als Hauptkohlenstoffquelle, und wir beobachteten, dass Threonin und Alanin, deren Vorläufer Pyruvat ist, jeweils ein markiertes Kohlenstoffatom aufweisen, während Isoleucin mit drei Kohlenstoffatomen markiert war. Somit kann die Synthese in Cyana thesei 5 1 1 4 2 nicht über die von den meisten Organismen verwendete Threonin-Routen ablaufen. Andererseits weisen Leucin und Isoleucin identische Markierungsmuster auf, basierend auf den Fragmenten M minus 15 und M minus 1 59.

Beispielsweise zeigten das Isotop oder die Daten von N-15-haltigen, UNFRAGMENTIERTEN Aminosäuren eine identische Markierung für Leucin und ISO-Leucin. Daher müssen Leucin und ISO-Leucin aus denselben Vorläufern, Pyruvat und Acetyl-CoA, synthetisiert werden. Diese Beobachtung stimmt mit dem markierten Kohlenstoffübergang im Citramalat-Weg für die Isle-Synthese überein.

Diese Methode kann verwendet werden, um den Stoffwechsel einer großen Vielfalt von Mikroben zu untersuchen, und kann, einmal beherrscht, innerhalb von etwa einer Woche von Anfang bis Ende durchgeführt werden.