Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Migration von Zellen in Echtzeit mithilfe von Zeitraffer-Videomikroskopie quantitativ zu messen. Dies wird erreicht, indem man zunächst eine sechswellige Kulturplatte mit Kollagen beschichtet und anschließend die gewünschten Zellen spärlich auf die beschichtete Platte aussät. Als zweiter Schritt wird mit einer Pipettenspitze eine Wunde in der Platte erzeugt, wobei ausreichend Platz für die Migration geschaffen wird.

Anschließend wird das Mikroskop eingerichtet und mithilfe eines Temperaturregelsystems in regelmäßigen Abständen Bilder aufgenommen, um eine kontinuierliche Echtzeit-Beobachtung wandernder Zellen zu ermöglichen. Schließlich wird das Partikelspürprotokoll verwendet, um Unterschiede in der durchschnittlichen Geschwindigkeit und der Gesamtdisplazierung von Test- und Kontrollzellen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Avoidant-Chamber-Migrationsassay liegt darin, dass sie nicht auf quantitativen Endpunkt-Migrationsmessungen basiert.

Stattdessen ermöglicht es die kontinuierliche Überwachung und Berechnung verschiedener Parameter. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie bestimmte Gene oder Wirkstoffe die Migration von Tumorzellen beeinflussen. Zwei Tage vor dem Verfahren 1,5 Milliliter Kollagen, verdünnt in Opti-Medium, in jede Vertiefung einer sechswelligen Kulturplatte geben und die Platte dann über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, einen Tag vor dem Verfahren.

Suspendieren Sie die gewünschten Zellen in zwei Milliliter DMEM ergänzt mit FBS pro Vertiefung und überführen Sie die Zellen in jede Vertiefung der mit kollagenem ENC beschichteten Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am Tag des Eingriffs erzeugen Sie mit einer Pipettenspitze eine Wunde in den über Nacht kultivierten Zellen und waschen jede Vertiefung mit PBS, um jeglichen durch die Wunde entstandenen Abfall zu entfernen.

DMEM mit FBS zu den gespülten Vertiefungen hinzufügen und dann unter dem Mikroskop überprüfen, um sicherzustellen, dass ein sauberer Wundspalt erzeugt wurde. Nachdem die Mikroskopkamera und die Einrichtung für die Live-Zell-Bildgebung eingeschaltet wurden, die Platte über dem Mikroskoptisch positionieren. Die Platte mit der neuen Umweltkammer für Live-Zell-Analysen abdecken und den Thermostaten auf 37 Grad Celsius sowie das Kohlendioxid auf 5 % einstellen. Öffnen Sie nun die Slide-Book-Software in der Menüleiste.

Wählen Sie die Fokussteuerung aus, indem Sie auf die Schaltfläche mit dem F in einem Kreis klicken. Definieren Sie im Objektivkasten mithilfe des Dropdown-Fensters das Objektiv. Wählen Sie im Filterkasten die Einstellungen aus, um den Lichtweg zum I-Stück zu lenken. Wählen Sie den geeigneten Filter für die Hellfeldbeleuchtung aus und klicken Sie anschließend auf „Hellfeld öffnen“.

Öffnen Sie den Hellfeld-Verschluss. Wählen Sie nun den Hellfeld-Filter am Revolver und betrachten Sie die Probe durch das Okular, um die geeigneten Bereiche zu finden und die Probe scharfzustellen. Danach bewegen Sie den Filterrevolver, um den Lichtweg zur Kamera umzuschalten. Zum Aufnehmen von Bildern in der Slide-Book-Software klicken Sie auf Fokussteuerung, wählen XY, um verschiedene Positionen durch das Okular auszuwählen, und klicken Sie dann auf „Set Point“, um jede Position festzulegen.

Stellen Sie für die Bildaufnahme manuell den Fokus des auf dem Bildschirm angezeigten Kamerabilds fein ein und verwenden Sie dann die Werkzeuge im Fokussteuerungsfenster, um die Z-Position des Objekttisches anzupassen. Für optimale Ergebnisse fokussieren Sie auf flache zelluläre Ausstülpungen in der Nähe des Kontakts mit der Platte, um die Fokussierung zu erleichtern. Verwenden Sie den Schieberegler, um die Belichtungszeiten auf einen geeigneten Bereich für die Fokussierung einzustellen.

Wenn mehrere XY-Positionen ausgewählt wurden, stellen Sie die Fokussierung für jede einzelne Position ein, indem Sie die Fokussteuerung, dann xy und anschließend Besuchsposition auswählen. Wählen Sie im Diaspeicher die Kamera-Grafik aus der Menüleiste, dann Aufnahmetyp und danach Zeitraffer, um die Dauer des Experiments festzulegen.

Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü die gewünschte Verzögerung zwischen dem Beginn eines Zeitpunkts und dem Beginn des nächsten Zeitpunkts ein. In den Intervallfeldern wird das dritte Feld automatisch anhand der manuell eingegebenen Werte berechnet. Wählen Sie unter Mehrfach-XY-Aufnahme die Option „Mehrfachpunkteliste“ für Experimente mit mehr als einer XY-Position.

Benennen Sie abschließend die Datei, um die Datei zu speichern, gehen Sie zur Aufnahmesteuerung und wählen Sie „Erweitert“, dann „Spool“. Erfassen Sie anschließend im Speicher und speichern Sie in der Spool-Datei nach jedem Zeitpunkt. Beginnen Sie, indem Sie auf „Bild“ klicken.

Wählen Sie in der Menüleiste des Objektträger-Buchs im Dropdown-Menü „Importieren“ und klicken Sie anschließend auf Objektträger-Buchspule. Wählen Sie die gewünschten Objektträger-Buch-Dateien aus, die aus dem Migrationsversuch für verschiedene Felder und Zeitpunkte generiert wurden. Öffnen Sie die erste Datei, wählen Sie dann „Maske“ in der Menüleiste und anschließend das Partikel-Tracking-Protokoll aus dem Dropdown-Menü.

Wählen Sie im Menü zur Partikelverfolgung das manuelle Partikelverfolgungsprotokoll aus. Ein Fenster erscheint mit Start- und Endzeitpunkten. Um die zufällige Migration zu analysieren, wählen Sie die Maske und anschließend das Partikelverfolgungsprotokoll aus. Um erneut die Koordinaten für den Mittelpunkt des Objekts zu bestimmen, wählen Sie „Schwerpunkt der Fläche“.

Dann klicken Sie auf „Track“ und fortfahren. Wählen Sie nun die gewünschten Statistiken für jeden Pfad aus, wie beispielsweise die Verschiebung und die Durchschnittsgeschwindigkeit. Wie hier gezeigt, klicken Sie auf „Berechnen“, um die Statistiken anzuzeigen.

Ein Beispiel einer Analyse der zufälligen Migration, quantifiziert in Bezug auf die Geschwindigkeit, ist in diesem Feld dargestellt. Im Whisker-Diagramm zeigte sich in diesem Experiment eine Erhöhung der durchschnittlichen Geschwindigkeit in M-D-A-M-B 2 31-Zellen mit einem ausgeschalteten Tumorsuppressorgen. Im Vergleich zu den Kontroll-M-D-A-M-B 2 31-Zellen hier wurde die zufällige Migration der Zellen aus der ersten Abbildung hinsichtlich der Zellverschiebung analysiert.

Auch hier zeigte die Gruppe mit vollständiger Knockdown der Tumorsuppressorgene eine erhöhte Zellverlagerung im Vergleich zu den Kontrollzellen M-D-A-M-B 2 31. Die Zellen in diesem Zeitraffer-Video der Videomikroskopie-Kontrolle (MDA MB 2 31-Zellen) wurden über Nacht auf Kollagen ausgesät. Anschließend wurden die Bilder im Abstand von jeweils einer Stunde über einen Zeitraum von insgesamt 18 Stunden während der zufälligen Migration aufgenommen.

Beobachten Sie, wie sich die Zellen im Laufe der Zeit von ihren ursprünglichen Positionen entfernen. In diesem Film wurde die Migration von Testzellen des Typs M-D-A-M-B 2 31 nach einer Übernachtkultivierung auf Kollagen aufgezeichnet und analysiert. Beachten Sie, dass die Testzellen im Vergleich zu den Kontrollzellen im vorherigen Film eine stärkere Migrationsneigung aufweisen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die Untersuchung der Zellinvasion und Dynas angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Zellen in der Krebsmetastasierung nach ihrer Entwicklung spielen. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, die Zellmigration unter Verwendung isolierter Krebszelllinien zu untersuchen.