Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Das Mass-Squirm-Protokoll zielt darauf ab, die Aktivität von Lysin-Demethylasen mittels isotopischer Methylierung und MALDI-Massenspektrometrie zu quantifizieren. Führen Sie zunächst enzymatisch katalysierte Demethylierungsreaktionen an Peptiden mit methyliertem Lysin durch. Anschließend methylieren Sie die Peptidprodukte der Demethylase-Reaktion chemisch mit deuteriertem Formaldehyd, um einheitlich methylierte Peptide zu erhalten, die in der MALDI-Ionisation gleichartig ionisieren. Danach quantifizieren Sie jede Peptidart mittels Massenspektrometrie und berücksichtigen dabei isotopische Überlappungen. Um die relativen Mengen an un-, mono-, di- und trimethylierten Peptiden zu identifizieren, bestimmt die Mass-Squirm-Analyse die relativen Anteile jedes Demethylase-Reaktionsprodukts anhand von Massenänderungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der routinemäßigen Massenspektrometrie liegt darin, dass die Massenbewertung Unterschiede in der Ionisierung zwischen unterschiedlich methylierten Peptiden berücksichtigt. Die Idee zu diesem Ansatz entstand ursprünglich, als wir eine Methode zur Messung von Histon-Acetylierungsgraden unter Verwendung isotopisch schwerer Essigsäureanhydrid entwickelten. Die Herausforderung bei dieser Technik besteht in der Extraktion der Peakflächenwerte, was durch die Überlappung der isotopischen Hüllen der Peptide erschwert werden kann.

Für die Demethylase-Reaktion wurden 125 Nanogramm rekombinantes lysinspezifisches Demethylase-Enzym Typ eins mit 0,25 Mikrogramm biotinyliertem dimethyliertem Histon-H3-Peptid in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern Demethylase-Puffer kombiniert. Bereiten Sie außerdem eine Kontrollprobe mit 0,25 Mikrogramm Peptid ohne das LSD1-Enzym vor und inkubieren Sie die Reaktions- und Kontrollröhrchen zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Als Nächstes mischen Sie zur Herstellung von R2 20-Mikrometer-Porösen Kügelchen gleiche Volumina Kügelchen und Methanol.

Anschließend 10 Volumina Trifluoressigsäure-Formiat hinzufügen, acht Mikroliter poröser Kügelchen zu jeder Probe geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. In der Zwischenzeit zwei C18-ZipTips konditionieren, indem zweimal mit 20 Mikrolitern 0,1 %iger TFA, viermal mit 70 %igem Acetonitril in 0,1 %iger TFA und erneut viermal mit 0,1 %iger TFA pipettiert wird.

Als Nächstes laden Sie die beiden Proben auf die konditionierten ZipTips auf. Drücken Sie das Volumen mit einer Pipette durch das C 18-Harz. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gesamtvolumen beider Proben durch die ZipTips gedrückt wurde.

Anschließend die Zip-Spitzen zweimal mit 20 Mikrolitern 0,1 %iger TFA waschen, die Proben in 40 Mikrolitern Illusionspuffer eluieren und vollständig mit einem Speed-Vac-Konzentrator trocknen. Zunächst die Probe in 100 Mikrolitern 50 Millimolar Phosphatpuffer, pH 7,4, resuspendieren. Danach acht Mikroliter Bor-dimethylamin und 16 Mikroliter verdünntes Formaldehyd hinzufügen.

Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für zwei Stunden. Wiederholen Sie die reduktive Methylierung durch Zugabe von unmarkiertem Dimethylamin und deuteriertem Formaldehyd und inkubieren Sie für zwei Stunden. Beim dritten Mal fügen Sie unmarkiertes Dimethylamin hinzu und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für 15 Stunden.

Stoppen Sie die Reaktion mit 12,5 Mikrolitern eines einmolar Tris-Puffers, pH 7,4, und trocknen Sie die Probe vollständig in einem Vakuum-Konzentrator. Resuspendieren Sie zunächst die Kontroll- und Demythylase-Reaktionsproben in 100 Mikrolitern eines 50 Millimolar Phosphatpuffers, pH 7,4.

Jetzt acht Mikroliter poröse Kügelchen zu den Kontroll- und Demethylase-Reaktionsproben hinzufügen und wie zuvor gezeigt auf Zip-Tips sammeln. Mit zwei Mikroliter-Volumina eluieren und auf einer MALDI-Probenplatte bei Raumtemperatur zur Kristallisation trocknen lassen. Danach die Proben mittels Massenspektrometrie analysieren.

Öffnen Sie die Spektrodateien in der Arbeitssoftware und exportieren Sie sie in die M/z-Software. Überprüfen Sie die Reaktionsprodukte anschließend mittels Tandem-Massenspektrometrie. Bestimmen Sie zunächst das Peakflächenverhältnis der Kohlenstoff-13C2- und Kohlenstoff-13C4-Isotope relativ zum monoisotopischen Peak der Kontrollprobe.

Verwenden Sie diese berechneten Verhältnisse, um die relative Menge an Peptid in jeder Modifikationsform zu quantifizieren, die im Demethylase-Reaktionsansatz vorliegt. Das Enzym LSD1 kann effektiv in der Massenspektrometrie zur Quantifizierung der Lysin-Demethylierung eingesetzt werden.

Da die Kontrollreaktion keine reduktive Methylierung durchläuft, zeigt sie das typische isotopische Muster für dieses Peptid. Die resultierenden Peakflächen bestimmen die Hintergrundverhältnisse des Peptids in den Isotopenzuständen Kohlenstoff-13C₂ und Kohlenstoff-13C₄. Die Isotopenzustände sowie die Peakflächen aus dem Massenspektrum der Kontrollreaktion ermöglichen die Quantifizierung der relativen Menge des Peptids in jedem Modifikationszustand. In der Demethylase-Reaktion ergeben die Peakflächen aus diesen Kontroll- und Demethylase-Reaktionen 33,7 % dimethyliertes Lysin 4, 42,0 % monomethyliertes Lysin 4 und 24 % unmethyliertes Lysin 4.

Dieser Massensquam-Ansatz liefert wichtige Erkenntnisse für das Gebiet der histonbezogenen Epigenetik, beispielsweise darüber, wie die Demethylierung von Histon-Lysinresten zu verschiedenen Erkrankungen beiträgt. Obwohl dieses Methylierungs-Assay zur Untersuchung von Demethylasen eingesetzt wurde, kann es auch zur Untersuchung von Methyltransferasen verwendet werden.