Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse
22. Februar 2012
In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Maus Ischiasnerv zu zerschlagen. Diese Methode verwendet leicht verfügbar Arterienklemmen und einfach und reproduzierbar produziert komplette Ischiasnerv verknallt. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um Muskeln ganzen Halterungen für die Analyse der Nervenregeneration nach Ischiasnerv verknallt vorzubereiten.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Durchführung einer Ischiasnervenquetschung sowie zur Ganzpräparat-Analyse der Muskelreinnervation nach einer solchen Quetschung zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Ischiasnerv freigelegt wird, wobei die korrekte Anordnung chirurgischer Retraktoren sicherzustellen ist, um einen guten Zugang zum Nerv zu gewährleisten. Anschließend wird der Nerv mit einer hämostatischen Pinzette gequetscht und mit Aktivkohle markiert.
Entfernen Sie anschließend einzelne Muskeln, die vom Nervus ischiadicus innerviert werden, aus der Hinterextremität. Der letzte Schritt besteht darin, einzelne Muskeln nach der Immunfärbung für die Ganzpräparatanalyse zu präparieren. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass eine reproduzierbare Quetschung des Nervus ischiadicus einfach durchgeführt werden kann und dass Ganzpräparate von Muskeln zur Analyse der anschließenden Regeneration verwendet werden können.
Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass es eine einfache und reproduzierbare Technik zum Zerkleinern des Nervus ischiadicus und anschließenden Beurteilen der axonalen Regeneration bietet. Beginnen Sie das Verfahren mit der Anästhesie der Maus für den chirurgischen Eingriff mittels eines Cocktail aus 100 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 10 Milligramm pro Kilogramm Xylazin, der über eine intraperitoneale Injektion verabreicht wird, um postoperative Schmerzen zu minimieren. Die Maus erhält außerdem eine subkutane Injektion von 10 Milligramm pro Kilogramm Meloxicam.
Als Nächstes beide Hinterläufe vorsichtig mit einem chirurgischen Schermesser rasieren. Anschließend Nasenhaar-Enthaarungscreme zur vollständigen Entfernung der Haare auftragen. Die Haut mit einem sterilen Wattestäbchen und Betadine-Hautantiseife gründlich reinigen.
Anschließend mit einem sterilen, mit Wattestäbchen bestückten Applikator Augensalbe auf die Augen auftragen. Die Maus auf eine saubere Edelstahlplatte über einer vorgewärmten thermoregulativen Decke legen und die Körpertemperatur des Tieres bei 37 Grad Celsius halten. Danach alle Gliedmaßen festkleben.
Positionieren Sie das Hintergliedmaß sorgfältig symmetrisch, sodass das Kniegelenk einen rechten Winkel mit dem Körper bildet. Bedecken Sie anschließend das Operationsfeld unter dem Mikroskop mit einem sterilen Tuch. Führen Sie einen halbkreisförmigen Schnitt entlang der Mittellinie durch.
Lösen Sie die Haut vorsichtig von der darunterliegenden Muskulatur und klappen Sie sie von Zeit zu Zeit zurück. Geben Sie etwa 0,1 Milliliter sterile Kochsalzlösung auf, um den Operationsbereich während des Eingriffs feucht zu halten. Öffnen Sie anschließend die fasziale Ebene zwischen dem Musculus gluteus maximus und dem vorderen Kopf des Musculus biceps femoris.
Um den Nervus ischiadicus für eine chirurgische Kontrolle freizulegen. Der kontralaterale Nervus ischiadicus sollte exponiert und mobilisiert, aber intakt belassen werden. Anschließend die gluteale Muskulatur reponieren und vernähen.
Das experimentelle Ischiasnerv entblößen Sie auf die gleiche Weise mit Haken. Zur besseren Sichtbarkeit. Lösen Sie den Ischiasnerv vorsichtig mit einer Iris-Schere von dem umgebenden Bindegewebe.
Verwenden Sie dann die feinen 5-45-Forceps, um den Nerv am unteren Kiefer der äußerst feinen hämostatischen Forceps so zu positionieren, dass die drei Faszien nebeneinander und nicht übereinander ausgerichtet sind. Die hämostatischen Forceps weisen eine Gravurmarkierung bei 1,5 Millimetern von ihrer Spitze auf. Bringen Sie den äußersten Abschnitt des Nervus ischiadicus vor dem Zerquetschen mit dieser Markierung in eine Linie.
Dies gewährleistet eine gleichmäßige Breite der Quetschung und verhindert, dass der Nerv über die Backen der hämostatischen Pinzette hinausragt, wenn er durch die Quetschkraft abgeflacht wird. Wenn der Nerv über die Spitzen der Pinzette hinausragt, wird er nur teilweise gequetscht. Verwenden Sie ein zweites Paar hämostatischer Pinzetten, das zuvor in pulverisierten Kohlenstoff eingetaucht wurde, um die Quetschstelle zu markieren.
Zerquetschen Sie den Nerv an derselben Quetschstelle 15 Sekunden lang mit drei Klicks. Keine Kohlenstoffmarkierung sollte über die Grenze der ursprünglichen Quetschung hinausreichen. Dies ist besonders wichtig, wenn eine präzise Markierung der Quetschstelle erforderlich ist, um die Pinzette vorab in Kohlenstoff einzutauchen und eine weiträumige Verteilung von Kohlenstoff am Operationsort auszuschließen.
Öffnen Sie die Pinzette in gepulvertem Kohlenstoff. Schließen Sie sie dann vorsichtig. Wischen Sie mit steriler Gaze den Kohlenstoff von der Außenseite der Hämostaseklemme ab.
Überprüfen Sie die Pinzette unter mindestens dreifacher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass die Quetschflächen gleichmäßig mit pulverförmigem Kohlenstoff beschichtet sind. Gegebenenfalls werden sie erneut eingetaucht und abgewischt, und die Gesäßmuskulatur wird genauso wie auf der kontralateralen Seite vernäht. Schließen Sie schließlich den Hautschnitt mit den neun Millimeter langen Reflexclips.
Wenn sich herausstellt, dass neun Millimeter große Reflexklammern die Bewegung einschränken, können kleinere Reflexklammern oder sechs Aut-Suturen verwendet werden. Alternativ entfernen Sie nach der Tötung der Maus vier Muskeln: den Musculus tibialis anterior, den Musculus extensor digitorum longus, den Musculus peroneus longus und den Musculus soleus der Hintergliedmaße, wobei diese vorsichtig durch ihre Bindegewebsanteile an eine schwarz lackierte Petrischale angeheftet werden.
Spülen Sie sie anschließend mit PBS. Fixieren Sie sie danach 30 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd. Um jeden Muskel in einer schwarzen, mit Sardinenöl beschichteten Petrischale zu präparieren, entfernen Sie die Sehnen mit einer Iridotomieschere.
Danach verdünnen Sie die Muskeln, indem Sie vorsichtig die inneren Muskelfasern ablösen. Bewahren Sie dabei die äußere Oberfläche des Muskels sorgfältig auf, einschließlich der Endplattenbänder. Anschließend montieren Sie die resultierenden Muskeln auf Plus-Objektträgern mit Vectashield und 22 mal 40 Millimeter großen Glasdeckgläsern und versiegeln zwei Seiten mit klarem Nagellack. Nach der korrekten Montage auf dem Objektträger sollten die Endplattenbänder mit den Deckgläsern in Kontakt stehen.
Hier ist ein Beispiel einer Quetschstelle *in situ* am linken Hintergliedmaß. Die Quetschstelle wird durch schwarzen Kohlenstoff angezeigt. Der Stern markiert ein Ast des Nervus tibialis, der die Oberschenkelmuskulatur innerviert und als nützlicher Orientierungspunkt dient.
Während der Crush-Operation wird die tibiale Abteilung des Nervus ischiadicus in Blau dargestellt, die peronäale in Grün und die Srel in Gelb. Dieser dünne Schnitt zeigt einen vollständigen Crush, der mit einer hämostatischen Pinzette durchgeführt wurde. Pfeilspitzen weisen hier auf die zerquetschten Fasern hin.
Ein unvollständiges Zerkleinern, das mit den schräg stehenden Pinzetten durchgeführt wurde, ist in einem weiteren halben Querschnitt sichtbar. Pfeilspitzen zeigen erneut zerkleinerte Fasern an, während Pfeile erhaltene Axone markieren. Dies sind die gerenderten Bilder aus den Ganzpräparaten der Muskeln.
Nach Entfernung des Bindegewebes und anschließender Verdünnung werden die nplate-Bänder an jedem Muskel umrissen. Dargestellt ist hier der gesamte Muskelpräparat im Whole-Mount-Verfahren. 14 Tage nach der Quetschung des Nervus ischiadicus.
Die Pfeile zeigen Bereiche der neuromuskulären Junction, die durch ein Axon wiederinnerviert wurden. Hier ist die Darstellung einer denervierten neuromuskulären Junction. Die gap-43-positiven Fortsätze von Schwann-Zellen sind durch Pfeilspitzen markiert.
Es sind keine Axone an dieser denervierten neuromuskulären Verbindung zu sehen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen ruhenden Nerv reproduzierbar zerquetscht und Muskelpräparate zur Analyse der Regeneration vorbereitet.
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Übersicht
Dieser Bericht beschreibt eine einfache und reproduzierbare Methode zum Zerkleinern des Ischiasnervs der Maus und zur Analyse der Muskelreinnervation. Die Technik nutzt leicht verfügbare hämostatische Pinzetten, um eine vollständige Nervenquetschung zu erzielen, und beinhaltet die Herstellung von Muskel-Ganzpräparaten zur Regenerationsanalyse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Regenerative Medizin
- Muskelphysiologie
Hintergrund
- Verletzungen des Nervus ischiadicus können zu erheblichen motorischen Defiziten führen.
- Das Verständnis der Nervenregeneration ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Strategien.
- Mittels Ganzpräparat-Analyse lassen sich Erkenntnisse über die Reinnervation von Muskeln gewinnen.
- Bestehende Methoden weisen möglicherweise Mängel in Bezug auf Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit auf.
Zweck der Studie
- Eine reproduzierbare Methode zur Quetschung des Nervus ischiadicus demonstrieren.
- Muskelpräparate für die anschließende Analyse der Nervenregeneration vorbereiten.
- Ein einfaches Protokoll bereitstellen, das leicht von Forschern übernommen werden kann.
Verwendete Methoden
- Legen Sie den Nervus ischiadicus mit chirurgischen Retraktoren frei.
- Quetschen Sie den Nerv mit einer Hämostaseklemme und markieren Sie ihn mit Aktivkohle.
- Entfernen Sie einzelne vom Nervus ischiadicus innervierte Muskeln aus der Hinterextremität.
- Präparieren Sie die Muskeln nach Immunfärbung zur Ganzpräparat-Analyse.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine konsistente und vollständige Quetschung des Nervus ischiadicus.
- Muskuläre Ganzpräparate können effektiv auf Regeneration analysiert werden.
- Die Ergebnisse belegen die Durchführbarkeit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Nervenreparatur.
- Die Befunde tragen zum Verständnis der Prozesse der Muskelreinnervation bei.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein zuverlässiges Werkzeug für Forscher dar, die Nervenverletzungen untersuchen.
- Die Ganzpräparat-Analyse ist eine wertvolle Technik zur Beurteilung der muskulären Reinnervation.
- Das Protokoll kann problemlos in verschiedenen Forschungsumgebungen implementiert werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode bietet ein reproduzierbares Modell zur Untersuchung der Regeneration peripherer Nerven und ermöglicht die mechanistische Absicherung therapeutischer Zielstrukturen in präklinischen Neurowissenschaftsprogrammen. Durch die Standardisierung des Ischiasnerv-Quetschtraumas und die Quantifizierung der Reinnervation mittels Ganzpräparat-Analyse von Muskulatur unterstützt sie die Validierung von Zielstrukturen und die Entwicklung von Assays für neuroprotektive oder neuroregenerative Wirkstoffkandidaten. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er das axonale Wachstum mit funktionellen Reinnervationsparametern verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen zur axonalen Regeneration und zu Wechselwirkungen von Schwann-Zellen in einem genetisch zugänglichen Modell.
- Operativer Wert: Nutzt weit verbreitete transgene Mauslinien, um molekulare Mechanismen der Nervenreparatur mit hoher Reproduzierbarkeit aufzuklären.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, bildgebungsgeeignete Ergebnisse (z. B. Reinnervation von neuromuskulären Verbindungen) für High-Content-Screenings von Substanzbibliotheken.
- Operativer Wert: Standardisiert die Markierung der Quetschstelle und die Muskelpräparation, um die Assay-Konsistenz über verschiedene Labore und Zeitpunkte hinweg sicherzustellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem eine klinisch relevante periphere Nervenverletzung, die Axonotmesis, modelliert wird.
- Operativer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung durch langzeitliche, strukturell-funktionelle Korrelation der Regeneration.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung eines Targets bis hin zur Identifizierung eines Leitwirkstoffs ein und bietet ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung von Biologika oder kleinen Molekülen, die darauf abzielen, die Nervenreparatur zu verbessern.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die funktionelle Zielvalidierung, indem die präzise Messung der Kinetik der axonalen Regeneration ermöglicht wird.
- Screening: Stellt versuchsfertige Gewebeproben bereit, die quantifizierbare abhängige Variablen (z. B. reinnervierte Endplattenbänder) zur Beurteilung von Substanzeffekten enthalten.
- Analytik: Erzeugt statistische Auswertungen aus Ganzpräparat-Aufnahmen, die den Vergleich der Regenerationswirksamkeit unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Bietet Anschluss an die präklinische Kontinuität, da ein Nagetiermodell verwendet wird, das die Reaktionen des menschlichen peripheren Nervensystems auf Läsionen vorhersagt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, skalierbare Plattform für den wiederholten Einsatz in Kampagnen zur Risikominderung von Zielstrukturen und zur Optimierung von Leitverbindungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei der Target-Validierung durch direkte Visualisierung der Interaktionen zwischen Axonen, Schwann-Zellen und Basallamina.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Quetschkraft, Markierung der Verletzungsstelle und Whole-Mount-Protokoll für Muskelpräparate.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem objektive, histologiebasierte Regenerationsparameter frühzeitig in der Pipeline bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung neuroregenerativer Wirkstoffkandidaten basierend auf Daten zur funktionalen Reinnervation.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie, Gewebedissektion und Immunfluoreszenzfärbung.
- Hängt vom Zugang zu Stereomikroskopen, hämostatischen Pinzetten und Abbildungssystemen für die Ganzpräparat-Analyse ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich Dauer der Quetschung, Markierungstechnik und Zeitpunkt der Muskel fixation.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Modell auf verschiedene Mausstämme oder genetische Hintergründe angewendet wird.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit terminaler Eingriffe und geschickter Handhabung, um die Konsistenz der Quetschung und die Genauigkeit der Markierung aufrechtzuerhalten.
