Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Dieses Protokoll ist optimiert, um pluripotente humane embryonale Stammzellen einzukapseln und sie in einem 3D-System in dopaminerge Neuronen zu differenzieren. Zunächst behandeln Sie die Kolonien mit Rock-Inhibitor oder RI und dissoziieren sie in Einzelzellen mit Acuat, das mit Natriumalginat gemischt wurde, und führen die Mischung durch die Einkapselungsvorrichtung. Setzen Sie die RI-Behandlung drei Tage lang fort, übertragen Sie die eingeschlossenen Zellen auf PA-sechs-Zellen und differenzieren Sie sie 28 Tage lang.

Schließlich zeigen die Analyse der Gen- und Proteinexpression eine höhere Effizienz bei der Generierung dopaminerger Neuronen. Der wesentliche Vorteil dieser speziellen Technik gegenüber dem bestehenden 2D-Differenzierungsprotokoll besteht darin, dass wir versuchen, diese Zellen und zu differenzieren unter 3D-Bedingungen zu kultivieren, und diese 3D-Umgebung bietet die Möglichkeit, die Zellen in hoher Dichte zu vermehren. Außerdem ergibt sich die Gelegenheit, eine bessere Zell-Zell-Interaktion während der Differenzierung zu ermöglichen.

Und drittens ermöglicht dies auch eine bessere Differenzierungseffizienz im weiteren Verlauf. Außerdem, wenn ich das hinzufügen darf, kann diese spezielle Technik auch an andere Zelltypen angepasst werden, die wir in einer 3D-Umgebung kultivieren können. Beachten Sie außerdem, dass diese Technik speziell unter Verwendung eines bestimmten ROCK-Inhibitors optimiert wurde, der die Apoptose der Zellen verhindert und gleichzeitig ein Abheben der Zellen von den Kulturschalen verhindert.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, am Anfang Schwierigkeiten haben, da diese Technik in der Gewebekultur normalerweise nicht durchgeführt wird. Die folgende Einhüllungstechnik wurde basierend auf den Zusammenfassungsstudien von Dr. Dean Dr. Chad zur Anwendung von R-Inhibitor-Typ-Alginat, Alginatkonzentration und Einstellungen des Einhüllungsgeräts optimiert. Jamie und Kim, ein Doktorand aus unserem Labor, werden nun diesen Protokollablauf demonstrieren.

Geben Sie 25 Milliliter sterile 0,1 %ige Gelatinelösung zu 275 Milligramm gereinigtem Natriumalginat in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und wirbeln Sie die Mischung, um das Alginatpulver teilweise aufzulösen. Anschließend stellen Sie das Röhrchen über Nacht auf einen Rotationsmischer mit 10 × g. Danach geben Sie 9 %ige sterile Natriumchloridlösung zur Alginatlösung hinzu.

Vortexen Sie 30 Sekunden lang und zentrifugieren Sie anschließend bei 95 × g für fünf Minuten. Lagern Sie die Alginate-Lösung bei vier Grad Celsius. Behandeln Sie die humanen embryonalen Stammzellen zunächst in einer dunklen Umgebung mit Kulturmedium, das mit 10 µM Rock-Inhibitor ergänzt wurde.

2 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Zellen zweimal mit DPBS waschen, um die Zellen enzymatisch zu lösen. Accutase hinzufügen und 10 Minuten inkubieren.

Bei 37 Grad Celsius die Zellen vorsichtig mit einem Zellabstreifer lösen und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Die Accutase mit einem gleichen Volumen SL-Medium neutralisieren. Anschließend die neutralisierten Zellen durch einen 40-Mikron-Filter in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben.

Verwenden Sie nun ein Hämocytometer, um die Zellen zu zählen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig das Überstand. Waschen Sie die Zellen anschließend einmal mit vorgewärmtem Puffer.

0,9 % Natriumchlorid. Zentrifugieren Sie Ihr Gewinn und verwerfen Sie den Überstand. Um die humanen embryonalen Stammzellen einzukapseln, resuspendieren Sie die Zellen zunächst mit vorgewärmter Alginate-Lösung.

Befestigen Sie dazu eine 20-Milliliter-Spritze an einem weichen Kunststoffschlauch und saugen Sie Alginate in die Spritze auf. Mischen Sie dann die Zellsuspension vorsichtig mit der Spritze, ohne Blasen zu erzeugen. Saugen Sie nun die Zellen in die Spritze auf.

Entsorgen Sie die Plastikschlauchleitung und befestigen Sie dann die Spritze an der Kapselungsmaschine. Fahren Sie mit der Instrumenteneinrichtung des Perlenherstellers, der Spritzenpumpe, des Luftstrommessgeräts und des Kalziumchlorid-Fällungsbades fort. Überprüfen Sie einen Abstand von 10 Zentimetern zwischen dem Ende der Kapselungsmaschine und dem Sammelpunkt der Petrischale.

Als Nächstes stellen Sie die Spritzenpumpe auf 10 Milliliter pro Stunde ein. Luftstromrate bei acht Litern pro Minute und einem Druck von 100 Kilopascal. Sammeln Sie die verkapselten Zellen sieben Minuten lang in einem vorgewärmten Fällbad.

Anschließend werden sie vorsichtig durch Aspiration in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, das 20 Milliliter 0,9 %iger Natriumchloridlösung enthält. Man lässt die Kapseln auf den Boden des Röhrchens absinken, entfernt vorsichtig den Überstand und wäscht sie einmal mit 0,9 %iger Natriumchloridlösung. Danach werden die gekapselten Zellen in vorgewärmtem Kulturmedium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor, resuspendiert. Das Gemisch wird in einen Kulturgefäßkolben überführt und drei Tage lang inkubiert.

Säen Sie die murinen stromalen Zellen der Linie PA6 in einer mit 0,1 % Gelatine beschichteten T75-Flasche aus und konditionieren Sie das dopaminerge neuronale Differenzierungsmedium 24 Stunden lang. Überführen Sie die Kapseln in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie sie sich am Boden des Röhrchens absetzen. Entsorgen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Kapseln in PA6-Zell-konditioniertem dopaminergen neuronalem Differenzierungsmedium.

Kulturmedium. Die eingeschlossenen humanen embryonalen Stammzellen mit der PA6-Zellmonoschicht für 21 Tage. Bei der Erneuerung des Mediums wechseln.

Jedes Mal die Hälfte des Mediums belassen, um die PA6-Zellen in dopaminerge neuronale Differenzierung weiterzukultivieren. Medium eine Woche lang mit induzierenden Faktoren supplementieren. Zunächst die Kapseln abpipettieren und in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Wenn die Kapseln auf den Boden gesunken sind, entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie zweimal mit DPBS und entfernen Sie jeweils den Überstand. Geben Sie anschließend fünf Milliliter Dekap-Zelllöse-Lösung hinzu und mischen Sie die Suspension gründlich.

Ansatz fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Zentrifugieren des Pellets die entkappten Zellen abgießen und zweimal mit DPBS waschen; anschließend die entkappten Zellen entweder als Monolayer-Kultur verwenden oder direkt weiteren Analyseverfahren unterziehen. Bei einer typischen Herstellung liegt der Durchmesser der Alginate-Mikrokapseln zwischen 400 und 500 Mikrometer.

Hier C-F-D-A-P-I-Assay. Die Ergebnisse zeigen die grünen, vitalen, eingeschlossenen Zellen bei 80 %; Analysen der Vitalität, Proliferation und Apoptose eingeschlossener humaner embryonaler Stammzellen zu verschiedenen Zeitpunkten dienen der Optimierung der Kultivierungsbedingungen. Interessanterweise verhindern Rock-Inhibitoren die durch Dissoziation induzierte Apoptose und erhalten die Zellviabilität, was auf ein überlegenes Wachstum eingeschlossener humaner embryonaler Stammzellen in H-F-F-C-M plus ri hindeutet.

Dieses Beispiel nutzt die Zellenkapselung als 3D-Plattform, um eingekapselte humane embryonale Stammzellen in dopaminerge Neuronen zu differenzieren. Wie erwartet nimmt die Größe der Embryoidkörper mit der Zeit zu; nach zwei bis drei Tagen Kultur zeigen die entkapselten Zellen eine fortschreitende neuronale Morphologie mit einer Vitalität von über 90 %. Die Genexpressionsanalyse zeigt eine Herunterregulierung des Pluripotenzmarkers OCT4.

Wichtig ist, dass der neuroprogenitorische Marker PAC six und der dopaminerge Neuronenmarker th nach sieben Tagen Differenzierung weiterhin hochreguliert sind. Nach 21 Tagen zeigen weiter differenzierte humane embryonale Stammzellen mehr als 90 % TH-positive Neuronen. Die Western-Blot-Analyse bestätigt die günstigen Expressionsmuster von TH und PAC six in 3D-im Vergleich zu 2D-Zellkultursystemen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie effektiv innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Denken Sie daran, die Zellen vor und nach der Einbettung mit einem ROCK-Inhibitor zu behandeln. Variante Induktoren oder Inhibitoren können das 3D-Differenzierungsprotokoll für zukünftige Experimente anpassen.

Diese spezielle Technik der Einschließung menschlicher ESL und deren Differenzierung in einer 3D-Umgebung bietet ein Potenzial für die Zelltherapie einer Vielzahl von Erkrankungen, insbesondere der Parkinson-Krankheit.