Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Um konstruierte Gewebekonstrukte zu untersuchen, ist die traditionelle mechanische Prüfung, die häufig zur Zerstörung der Probe führt, nicht akzeptabel. Diese Methode verwendet die mikroskopische Magnetresonanz-Elastographie oder Mikro-MRE als nichtinvasive Technik zur Messung der mechanischen Eigenschaften kleiner weicher Gewebe. Zunächst werden Zellen auf ein Biomaterialgerüst gesät, um Gewebe zu erzeugen.

Das Gewebe wird in ein Aros-Gel suspendiert, und die Spitze eines Aktuators wird in das Gel gebracht. Anschließend wird die Bewegung des Aktuators charakterisiert, auf die Probe übertragen und mithilfe eines Lasers detektiert. Doppler-Viter.

Die Probe und der Aktuator werden in ein Magnetresonanztomographie-Gerät überführt. Es werden Elastographie-Bilder aufgenommen. Die Analyse der entstandenen Bilder zeigt die Änderung der Schersteifigkeit sowohl für osteogene als auch für adipogene Konstrukte.

Wir hatten zunächst die Idee für diese Technik, als wir die magnetische Residenzphotographie zur Diagnose von Krankheiten beobachteten, und erkannten, dass sie auf das Gewebegengineering übertragen werden könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Verfahren wie der mechanischen Prüfung liegt darin, dass sie die nicht-invasive Technologie der MRT auf wichtige mechanische Eigenschaften von Geweben anwendet. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik reichen bis ins Gewebegengineering, da die Kenntnis der mechanischen Eigenschaften sicherstellt, dass sie für den vorgesehenen Einsatz in der Knochen- und Knorpelgewebeherstellung geeignet ist.

Obwohl diese Methoden wertvolle Einblicke in das Gewebeengineering ermöglichen, können sie auch zur Diagnose von Erkrankungen in verschiedenen Organen wie beispielsweise Leberfibrose, traumatischer Hirnverletzung oder Hirntumor verwendet werden. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da sie Schritte umfasst, die schwer zu erlernen sind, und Grundkenntnisse im Gewebeengineering sowie in der MRT-Bildgebung voraussetzt. Der Prozess der Gewebekonstrukt-Herstellung besteht aus drei Hauptphasen: der Expansion der Zellpopulation, der Aussaat der Zellen auf ein biomaterialbasiertes Gerüst und der Differenzierung mittels chemischer Signalstoffe.

Nach der Kultur und Vermehrung der Zelllinie säen Sie die humanen mesenchymalen Stammzellen oder HMCs mit einer Dichte von einem Mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter auf einen Gelatineschwamm für die Knochenbildung aus. Etwa drei Tage später sollten die Zellen auf dem Gerüst konfluent erscheinen, um die Differenzierung einzuleiten. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch Adipoinduktionsmedium.

Anschließend die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Das Medium durch Pflegemedium ersetzen, das aus Expandierungsmedium mit 10 Mikrogramm pro Milliliter humanem rekombinantem Insulin besteht. Nach einer 24-stündigen Inkubation das Pflegemedium durch Induktionsmedium ersetzen.

Wiederholen Sie diesen Zyklus dreimal. Ersetzen Sie das Erhaltungsmedium danach alle zwei Tage während vier Wochen, um die Osteogenese zu induzieren. Ersetzen Sie das Medium während der gesamten Studiendauer alle zwei Tage durch frisches osteogenes Medium.

Hier dauert die Studie vier Wochen, und jede Woche wird die MRE durchgeführt. Die Magnetresonanzelastographie beruht auf der Ausbreitung mechanischer Scherwellen, um lokale Werte mechanischer Eigenschaften zu bestimmen. Daher müssen diese mechanischen Vibrationen innerhalb des interessierenden Gewebes mittels eines piezoelektrischen Aktors erzeugt und charakterisiert werden. Um die Probe vorzubereiten, überführen Sie die Gewebekultur in ein Reagenzglas mit 10 Millimeter Durchmesser, das einen festen Boden und eine Schicht aus 0,5 %iger AGAROS-Gel enthält.

Dann warmes 0,5 Acro-Gel hinzufügen, um es einzuschließen. Lassen Sie das Agros-Gel fünf Minuten lang aushärten.

Bei Raumtemperatur die Spitze des piso-elektrischen Biegemotors in die Oberfläche des Gels einführen. Anschließend das Rohr mit der Probe und dem mechanischen Aktor an einer starren Halterung befestigen. Den Laserstrahl des Laser-Doppler-Barometers auf die Spitze des mechanischen Aktors ausrichten.

Passt die Positionierung des Systems an, um die Stärke des reflektierten Signals, das auf dem Messgerät angezeigt wird, zu optimieren. Um die Reflexion zu maximieren, verwenden Sie gegebenenfalls reflektierendes Klebeband, um den Aktuator so einzurichten, dass er ungefährliche Scherwellen mit signifikanten Amplituden von etwa 250 Mikrometern erzeugt. Stellen Sie den Funktionsgenerator so ein, dass er mithilfe einer Betriebsspannung von 20 Volt Spitze zu Spitze und einem weißen Rauschsignal den gewünschten Frequenzbereich abtastet.

Für dieses Experiment liegt der gewünschte Frequenzbereich zwischen 20 und 2000 Hertz. Um das charakterisierte Spektrum im Polytech Rsof-Programm anzuzeigen, wählen Sie Geschwindigkeit und FFT-Anzeige aus. Beginnen Sie mit der Aufnahme des Signals und identifizieren Sie die Resonanzfrequenz des Systems anhand der Peaks im Spektrum.

Als Nächstes, um die Auslenkung des Aktors zu messen, stellen Sie den Aktor so ein, dass er einen kontinuierlichen Sinusverlauf bei der charakterisierten Resonanzfrequenz abgibt. Verwenden Sie eine Betriebsspannung von 200 Volt Spitze-zu-Spitze und kennzeichnen Sie die erzeugte Verschiebung, die der Aktor an die Oberfläche des Gel-Set-Faser-Weichmaterials überträgt, um die FFT mit der Verschiebung als Y-Achse anzuzeigen. Sobald der Aktor charakterisiert wurde, stellen Sie das Reagenzglas mit der Probe und dem Aktor in einen Schlitz einer 10-Millimeter-RF-Spule und platzieren Sie die Probe und den Aktor in der Mitte des MRT-Scanners.

Erfassen Sie ein Übersichtsbild zur Identifizierung der Position des Konstrukts. Sobald das Gewebekonstrukt lokalisiert wurde, legen Sie die Parameter für die Aufnahme fest. Eine typische in-vitro-sagittale Aufnahme weist eine Wiederholungszeit von 1000 Millisekunden auf.

Echozeit von 20 bis 40 Millisekunden, Schichtdicke von 0,5 bis 1 Millimeter und Bildfeld von 12 mal 10 Quadratmillimeter mit einer Matrixgröße von 128 mal 128 Pixeln. Bei den Elastographie-Parametern wird die Aktuatorfrequenz auf den Wert eingestellt, der durch die Laser-Doppler-Vibrometer-Charakterisierung bestimmt wurde. Für diese Probe wird ein Bipuls benötigt, mit einer Gradientenamplitude von 50 Gauss pro Zentimeter und einer MRE-Verzögerung, die auf null gesetzt ist.

Stellen Sie den Funktionsgenerator auf Burst-Modus um und passen Sie die Parameter des Funktionsgenerators an die Parameter der Elastographie-Aufnahme an, einschließlich Frequenz und Anzahl der Zyklen. Stellen Sie außerdem sicher, dass der Funktionsgenerator extern ausgelöst wird. Um ein sagittales Bild zu erhalten, stellen Sie die Bewegungssensibilisierung in positive Schichtrichtung ein und starten Sie die Aufnahme nach der Datenerfassung.

Überprüfen Sie das Bild, um die Signalqualität im Gewebekonstrukt zu beurteilen. Falls das Bild zu dunkel erscheint, passen Sie die MR-Parameter an und nehmen Sie eine weitere Aufnahme vor. Ändern Sie anschließend die Sensitivierung auf die negative Slice-Richtung.

Übertragen Sie die Dateien vom MRT-Scanner auf einen anderen Computer, der mit MATLAB ausgestattet ist, und führen Sie das MATLAB-Programm aus, das eine komplexe Division zur Erzeugung eines Bildes der Scherwellenausbreitung durchführt. Bewerten Sie das Bild auf das Vorhandensein von Scherwellen und mögliche Artefakte; Phasenüberlagerungs-Linienprofile können zur besseren Beurteilung der Qualität und Amplitude der Welle dargestellt werden. Falls eine Überlagerung auftritt, verringern Sie die Gradientenamplitude und führen Sie einen weiteren Scan durch.

Falls keine Anpassungen am Bild erforderlich sind, stellen Sie die Größe des Parameter-Arrays auf acht gleichmäßig verteilte Werte ein, die von null Sekunden bis zu einer vollen Periode der charakterisierten Resonanzfrequenz reichen. Nehmen Sie eine Aufnahme sowohl in positiver als auch in negativer Schichtorientierung vor, sobald die Bilder erfasst sind.

Verwenden Sie ein MATLAB-Programm, das zur Erzeugung der Scherwellendaten und des entsprechenden Films der sich im Probenmaterial ausbreitenden Welle konzipiert ist. Diese Datei wird benötigt, um die mechanischen Eigenschaften zu bestimmen. Der letzte Schritt der MRE besteht darin, die Schersteifigkeit aus den Scherwellenbildern zu berechnen.

Beginnen Sie damit, die Daten in das MATLAB-Programm einzugeben, das den dreidimensionalen Datensatz auswerten soll, geben Sie die Bildgebungsparameter an, einschließlich Bildfeld, Gradient, Amplitude und Anzahl der bipolaren Paare, und führen Sie den Code aus. Der Algorithmus ermöglicht die Auswahl von interessierenden Bereichen, für die der Mittelwert und die Standardabweichung jedes Parameters berechnet werden. Zeichnen Sie die Konturen des Gewebekonstrukts, um den interessierenden Bereich auszuwählen.

Der Mittelwert und die Standardabweichung der Steifigkeit, des Speichermoduls und des Verlustmoduls innerhalb des ausgewählten Bereichs von Interesse werden angezeigt. Das Programm liefert außerdem Zwischenergebnisse, darunter die Welle nach Filterung, die Welle nach Richtungsfilterung und Linienprofile, die bei der Beurteilung der Genauigkeit der Rekonstruktion helfen. Für eine genaue Schätzung muss die gefilterte Welle glatt sein.

Die Standardabweichung eines Parameters in einer bestimmten interessierenden Region ist ebenfalls ein Indikator für die Qualität der Berechnung; gegebenenfalls sind andere Parameter anzupassen, um genaue Werte der mechanischen Eigenschaften zu erhalten, um die Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von gewebetechnischen Konstrukten während ihrer Entwicklung zu beobachten. Die MRE-Prüfung wurde über einen Zeitraum von vier Wochen durchgeführt. Diese Karte der Konstruktentwicklung zeigt adipogenes, gekennzeichnet durch den Buchstaben A, und osteogenes, gekennzeichnet durch den Buchstaben O, mit entsprechenden Amplitudenbildern, Scherwellenbildern, ELAs sowie der durchschnittlichen Schubsteifigkeit.

Die Farbskala für die ELAs entspricht dem Farbschema der Balken. Diagramm und Fehlerbalken stellen die Standardabweichung innerhalb jedes Konstrukt-Interessenbereichs dar. Im Laufe der Zeit wurden die adipogenen Konstrukte weicher, was auf Eigenschaften hinweist, die dem Fettgewebe ähneln.

Auf ähnliche Weise nahm die Steifigkeit der osteogenen Konstrukte über den Zeitraum von vier Wochen hinweg zu, was auf eine knochenähnliche Differenzierung hinweist. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Aktuator vollständig zu charakterisieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie die biochemische Analyse und die Histologie verwendet werden, um Fragen wie die Bestätigung der Mineralablagerung zu beantworten.

Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit menschlichem Zellmaterial und MRT äußerst gefährlich sein kann und ein Bewusstsein für die korrekte Biosicherheitsstufe zwei und MRT erforderlich ist. Bei der Durchführung dieser Verfahren sollten entsprechende Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.