Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine effiziente Methode zu verwenden, um gleichzeitig Informationen aus mehreren Geweben über die Proteinausprägung in einem Hochdurchsatzprojekt wie dem Human Protein Atlas zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst repräsentative Bereiche von formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Geweben ausgewählt werden. Anschließend werden die markierten Bereiche ausgestanzt und die ausgewählten Gewebekerne in einem einzigen Paraffinblock, einem Gewebemikroarray, zusammengefügt.

Anschließend werden Schnitte aus der TMA hergestellt und die Immunhistochemie durchgeführt. Schließlich wird das Proteinexpressionsmuster analysiert und die Daten im Human Protein Atlas veröffentlicht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Gewebemikroarrays und Immunhistochemie die Proteinexpression in Geweben und Zellen zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Durchführung von Immunhistochemie an einzelnen Gewebeparen-Blöcken, liegt darin, dass wertvolles biologisches Material eingespart werden kann und die Experimente besser reproduzierbar sind. Ein weiterer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sich sowohl die Kosten für das Entnehmen als auch die Laborverarbeitungszeit reduzieren lassen. Diese Prozedur wird Ian call Bay, ein Laborassistent aus meinem Labor, demonstrieren, um eine standardisierte Länge der Gewebekerne zu erhalten.

Markieren Sie den Stilett. Es wird empfohlen, an jeder Seite des Paraffinblocks einen Rand von 2,5 bis 3,0 Millimeter freizulassen, um Risse im Paraffin zu vermeiden und die geeigneten Stanzen anzubringen. Lösen Sie die Innensechskantschrauben, die die Stanzvorrichtung fixieren, und positionieren Sie die Stanzvorrichtung so, dass die Nut in der Stanznabe fest an der Metallstange im Kunststoff-V-Block anliegt.

Befestigen Sie die Schrauben, wobei sichergestellt werden muss, dass die Kante der Metallklemme horizontal ist. Setzen Sie die Rezipientenstanze auf der linken Seite und die Spenderstanze auf der rechten Seite ein. Verwenden Sie die XY-Verstellknöpfe und deren digitale Messuhranzeige, um die Stanzwerkzeuge entlang der X- und Y-Achsen zu bewegen.

Um das Gerät zurückzusetzen, drücken Sie die Nulltaste und die BS-Taste, um zwischen Zoll und Millimeter umzuschalten, drücken Sie die Zoll-Millimeter-Taste. Bei Verwendung eines 1-mm-Lochstanzers für eine 9×8-Vorlage sollte der Abstand zwischen den Löchern 2 mm betragen, gemessen zwischen den Mittelpunkten der Löcher, um zu verhindern, dass die Aufnahmestanze zu weit nach unten gedrückt wird und dadurch beschädigt wird. Stellen Sie die maximale Eindringtiefe für die Stanze ein, indem Sie eine leere Kassette in den Halter einsetzen und die Anschraubeinstellschraube in der oberen linken Ecke der Z-Führung verwenden. Stellen Sie die untere Position der Aufnahmestanze 1 mm über dem Boden der Kassette ein. Nachdem Sie den relevanten Bereich auf einem Gewebeschnitt ausgewählt und markiert sowie eine Vorlage für die Herstellung eines Gewebemikroarrays entworfen haben, setzen Sie den Empfängerblock in den Halter ein und befestigen Sie die Schrauben mit dem kleinsten Schraubendreher.

Vermeiden Sie es, die Schrauben übermäßig festzuziehen, um zu verhindern, dass das Paraffin sich aus der Kassette löst. Drücken Sie den Empfängerstempel etwa fünf Millimeter in den Empfängerblock hinein, und verwenden Sie den Griff des Stempels, um diesen vorwärts und rückwärts zu drehen. Danach verringern Sie den nach unten gerichteten Druck langsam, sodass die Federn den Stempel nach oben bewegen können.

Verwenden Sie den Stil, um den Stanzzylinder zu leeren und den Paraffinkern zu entsorgen. Drehen Sie anschließend das Revolvermagazin, um auf die Donatorstanznadel umzuschalten. Platzieren Sie danach die Donatorblockbrücke mit dem Donatorblock über dem Rezipientenblockhalter.

Verwenden Sie eine entsprechende Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Objektträgerpräparat, bei dem der interessierende Bereich markiert wurde, um das zu entnehmende Gewebe zu lokalisieren. Halten Sie den Donorblock mit der linken Hand manuell in Position und drücken Sie die Bohrstanznadel mit der rechten Hand vorwärts. Drücken Sie nicht auf den Innenstil. Die Anschlagvorrichtung blockiert die Bewegung der Stanznadel nicht in der korrekten Position für den Donorblock, daher ist es wichtig, das Drücken zu stoppen, sobald die zweite Markierung am Innenstil sichtbar ist.

Drehen Sie den Griff der Lochvorrichtung einmal langsam. Lösen Sie den nach unten gerichteten Druck, während Sie den Donorblock weiterhin auf der Donorblockbrücke halten. Entfernen Sie die Brücke und den Donorblock.

Stellen Sie sicher, dass die Spenderbohrung mit dem zuvor angefertigten Loch ausgerichtet ist. Passen Sie die Position der Bohrung mit den Verstellmuttern an. Falls die Spenderbohrung und das Loch im Empfängerblock nicht ausgerichtet sind, drücken Sie die Bohrung vorsichtig nach unten, bis ihre Spitze die Oberseite des Lochs im Empfängerblock erreicht.

Während Sie diese Position halten, verwenden Sie den Stilett, um den Gewebekern in die Öffnung zu entleeren. Die Oberfläche des Kerns sollte mit der Oberfläche des Blocks bündig sein. Bewegen Sie das Revolvermagazin zurück zur Empfänger-Punze.

Verschieben Sie zur nächsten Position mit den XY-Verstellknöpfen und wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie eine Probe aus dem Empfängerblock entnehmen, bis das Array vollständig ist. Um den Empfängerblock zu entfernen, lösen Sie die Schrauben in der Halterung. Legen Sie den Block mit der Oberseite nach unten auf eine Glasobjektträger, die sich auf einem geeigneten Gestell befindet, und backen Sie den Block bei 42 Grad Celsius für 40 Minuten.

Entfernen Sie den Objektträger und den Block aus dem Ofen und glätten Sie die Oberfläche des Blocks, indem Sie vorsichtig mit dem Objektträger darüberstreichen. Stellen Sie den Block mit dem Objektträger auf eine Kühlplatte und lassen Sie ihn 10 Minuten lang abkühlen. Entfernen Sie den Objektträger vom Block.

Der Block ist nun fertiggestellt und bereit zum Schneiden. Nach dem Schneiden erfolgen die Färbung und Digitalisierung des Gewebemikroarrays mit einem Antikörper gegen ein Protein von Interesse. Suchen Sie das Protein im Human Protein Atlas, indem Sie die Website www.proteinatlas.org aufrufen.

Geben Sie den Ensemble-ID, die UniProt-Accountsnummer oder den HGNC-Namen einer gewünschten Proteins ein, zum Beispiel Insulin. Klicken Sie auf das gewünschte Protein und scrollen Sie nach unten zum Abschnitt „Zusammenfassung der Expression in normalem Gewebe und Organ“. Die Übersicht zeigt die Proteinausprägung in der Bauchspeicheldrüse.

Klicken Sie auf den Tab. Weitere Gewebedaten. Die Ansicht der normalen Gewebe, sortiert nach Organ, wird sichtbar.

Klicken Sie auf die Bauchspeicheldrüse, um die IHC-Ergebnisse für drei Antikörper zu sehen, die gegen dasselbe Protein gerichtet sind. Klicken Sie auf ein Bild, um eine hochauflösende Ansicht der Bauchspeicheldrüse anzusehen. In dieser Abbildung sind Beispiele für die Qualität von Gewebemikroarrays dargestellt: ein gerader und korrekt ausgerichteter Array mit ausreichendem Abstand zwischen den Reihen und Spalten sowie zum Rand des Paraffins. Hier liegen einige der Kerne zu nahe am Rand, was vermutlich Probleme beim Schneiden verursachen wird.

Dieses Gewebemikroarray wurde zu lange gebacken und ist ohne die korrekte Vorlage eingeklappt. Hier ist ein ordnungsgemäß geschnittener Schnitt mit geraden und ausgerichteten Reihen mit Hämatoxylin, Toin und Eosin gefärbt. Eine schlechte oder schmutzige Klinge könnte zu Teilungen wie hier gezeigt oder zu komprimierten Schnitten wie diesem führen.

Keimzentrumzellen in Lymphknoten zeigen eine optimal abgestufte Antikörperreaktion, die zu einer spezifischen cytoplasmatischen Färbung ohne Hintergrund führt, wie hier dargestellt. Eine negative oder schwache Färbung tritt auf, wenn die Konzentration des primären Antikörpers zu niedrig ist oder wenn das Zielprotein in den immunhistochemisch gefärbten Geweben nicht vorhanden ist. Dieser Gewebeschnitt ist durch eine zu hohe Konzentration des primären Antikörpers überfärbt.

Die dunkle Farbe führt zu Schwierigkeiten bei der Bestimmung des subzellulären Lokalisation aufgrund von Spillover, Kreuzreaktivität und falsch positiven Ergebnissen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Gewebemarker-Array herstellt und wie man es bei der Analyse der Proteinexpression mittels Immunhistochemie verwendet. Sie sollten außerdem ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man den Human Protein Atlas durchsucht, um die Proteinexpression in menschlichen Geweben und Zellen zu untersuchen.