Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine schnelle Bewertung der Genfunktion bei der Entwicklung der Großhirnrinde mithilfe von organspezifischen Schnitten durchzuführen. Dies wird erreicht, indem Plasmide, coex, exprimierende und inhibitorische RNA sowie einen GFP-Marker in die embryonale Großhirnrinde eingebracht werden. Kurze elektrische Impulse werden auf das Gehirn angewendet, wodurch die Plasmid-DNA in die neuronalen Vorläuferzellen transfiziert werden kann.

Anschließend werden die Gehirne disseziert, eingebettet und in Schnitte geteilt, um organspezifische Schnitte zu erzeugen, die ex vivo eine neuronale Morphogenese durchlaufen können. Mithilfe dieser organspezifischen Schnitte lassen sich kortikale Neuronensubpopulationen mit Wander- oder morphologischen Defekten identifizieren, indem die GFP-markierten Zellen direkt beobachtet werden. Hallo, willkommen heute in meinem Labor an der Brown University, Abteilung für Molekularbiologie. Dr. Liza sowie zwei Studenten, Kat Zer und Mark Seba, werden die ex-vivo-Elektroporationstechnik und die Kultur organspezifischer Schnitte demonstrieren, eine äußerst nützliche Methode für neurodevelopmentelle Untersuchungen.

Mit dieser Methode können Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen der Neuroentwicklung beantwortet werden, darunter Neurogenese, neuronale Migration und neuronale Morphogenese. Da die Analyse in einer annähernden Nachbildung der IBU-Umgebung durchgeführt wird, bietet sie eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung transgener oder Knockout-Tiere für Gene unbekannter Funktion. Schließlich hängt der Erfolg dieser in-vivo-Elektroporationsversuche im Vergleich zur in-vivo-Elektroporations-Technologie nicht von einer gekonnten Chirurgie ab, erfordert kürzere Trainingszeiten und kann mit geringerem fachlichem Können durchgeführt werden.

Nachdem ein trächtiges weibliches Mäuschen euthanasiert wurde, sezieren Sie die Embryonen in eiskaltes, vollständiges HBSS aus, wobei sie in ihren individuellen Plazentasäcken verbleiben. Danach lösen Sie in der kalten HBSS-Lösung einen Embryo aus dem Sack, schneiden ihm hinter der ersten Wirbelsäule den Kopf ab, setzen Sie den Kopf mit einer speziell angefertigten Hamilton-Spritze auf ein Stück Paraform-Papier, das auf einer Petrischale liegt, und injizieren sechs bis acht Mikroliter der DNA-Fast-Green-Mischung durch das dritte Ventrikel.

Dadurch füllt sich die Mischung in beiden Seitenventrikeln der kortikalen Vesikel. Für die Elektroporation werden BTX-Pinzettenelektroden aus Platin verwendet. Positionieren Sie die positive Elektrode auf der Seite des Kortex, die elektroporiert werden soll.

Beispielsweise sollte die Elektrode zur dorsalen Großhirnrinde auf dem Kopf platziert werden. Um eine hohe Transfektionseffizienz zu erzielen, sollte die DNA-Konzentration stets auf ein Mikrogramm pro Mikroliter eingestellt und DNA verwendet werden, die aus einer Maxi-Präparation isoliert wurde. Gegebenenfalls sollte nach der Elektroporation ein endotoxinfreies Kit zur Reinigung der DNA verwendet werden.

Den Kopf vor der Dissektion mindestens fünf Minuten auf Eis inkubieren. Es ist sehr wichtig, die richtige Menge elektrischer Impulse und Stromstärke bei der Elektroporation zu verwenden, um die jungen embryonalen Gehirne nicht zu schädigen. Nach der Elektroporation wird das Gewebe sehr empfindlich.

Es ist wichtig, die Dissektionen sehr sorgfältig durchzuführen, da Haut und Schädel an den Hirnhäuten der kortikalen Vesikel ziehen können, was diese bei der Entfernung aus dem Schädel beschädigen könnte. Nach fünf Minuten das Gehirn kühl herausschneiden. HBSS, indem man einen kleinen Schnitt an der Seite des Kopfes macht und die Haut von den Seiten des Kopfes ablöst.

Als Nächstes entfernen Sie mit feiner Pinzette vorsichtig die Pia von dem Gehirn. Entfernen Sie das intakte Gehirn aus dem Schädel. Bewahren Sie das Gehirn anschließend in eiskaltem HBSS auf und bereiten Sie die Einbettung des Gewebes vor.

Füllen Sie die Formen mit 3 % Low-Melting-Point-Agros auf. Stellen Sie die Formen auf Eis, damit sich das Agros nahe dem Boden der Form verfestigt. Achten Sie zunächst darauf, dass die Gehirne weiterhin unterstützt und zentriert bleiben.

Entfernen Sie nun vorsichtig mit feinen Pinzetten ein Gehirn aus dem HBSS, saugen Sie überschüssige Pufferlösung mit einem Kim-Tuch oder Filterpapier ab und legen Sie das Gehirn in das Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze, um das Gehirn innerhalb der Form zu drehen, um den Kontakt zwischen Agarose und Gewebe zu maximieren. Nachdem alle Gehirne übertragen wurden, positionieren Sie jedes Gehirn in etwa in derselben Orientierung und Tiefe innerhalb seiner Form.

Die Aros verfestigen sich in etwa fünf Minuten. Arbeiten Sie daher schnell. Lassen Sie die Aros vollständig verfestigen, indem Sie sie weitere fünf Minuten auf Eis inkubieren.

Schneiden Sie überschüssiges Aros vor dem Montieren der Blöcke ab. Befestigen Sie anschließend die Agros-Blöcke mithilfe eines schnell härtenden Kunststoffklebers aneinander, wobei jede Gehirnprobe in der Stapelung mit den Riechkolben nach oben ausgerichtet sein sollte. Sobald die Blöcke verbunden sind, beschneiden Sie das Aros, um sicherzustellen, dass jedes Gehirn durch den Vibratom geschnitten wird.

Bringen Sie sie dann sofort in eiskaltes HBSS ein. Zum Schneiden der Blöcke stellen Sie die Vibratome-Geschwindigkeit auf eine niedrige Drehzahl ein, etwa die Hälfte der maximalen, und stellen Sie die Schwingfrequenz der Klinge auf die höchste Einstellung. Erzeugen Sie dann 250 µm dicke koronare Schnitte, nehmen Sie die Schnitte mit einem gebogenen feinen Spatel auf und überführen Sie sie mit einem feinen Pinsel oder einer Pinzette in Gewebekammern.

Falls das Gewebe aus dem Agaroseblock herausfällt, wurde der Gewebe-Agarose-Kontakt im Gewebekulturhauben nicht ausreichend hergestellt. Bereiten Sie eine sechswellige Platte mit 1,8 Milliliter Schnittkulturmedium pro Vertiefung vor und geben Sie Organotypische Inserts mit Laminin-Poly-L-Lysin-Beschichtung in jede Vertiefung. Fügen Sie 500 Mikroliter Schnittkulturmedium auf die Oberseite der organotypischen Gewebeschnitt-Inserts hinzu. Überführen Sie anschließend bis zu fünf Schnitte in jeden Insert.

Als Nächstes entfernen Sie jegliche überschüssige Nährlösung von der Oberseite der Schnitte, um sicherzustellen, dass die Schnitte ihre Morphologie so weit wie möglich bewahren und minimale Zelltod aufweisen. Es ist wichtig, dass eine gesunde Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche aufrechterhalten wird und die Schnitte nicht in der Nährlösung schwimmen. Inkubieren Sie die Schnitte abschließend bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator.

Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediumvolumens unter der Membran. Die Schnitte sollten nicht auf dem Medium schwimmen. Neuronen, die elektroporierte Konstrukte exprimieren, können bereits acht Stunden nach der Elektroporation nach den gewünschten Kultivierungstagen sichtbar gemacht werden. Fixieren Sie die Schnitte in der Membran zur Analyse.

Jedes organische typische Insert fünf Minuten lang mit warmer PBS waschen. Insgesamt drei PBS-Spülungen durchführen und anschließend das Gewebe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit 4 % Paraformaldehyd fixieren. Nach der Fixierung können die Gewebe mit zellulären Markern analysiert oder einfach mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung gefärbt werden. Nach einer Stunde die Schnitte mit drei zehnminütigen Spülungen in 1× PBS waschen.

Anschließend die Schnitte zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung mit 10 % Ziegen-Serum in 1× PBS unter leichtem Schütteln permeabilisieren. Danach die Gewebe eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit den Antikörpern inkubieren. Entfernen Sie die Färbung durch drei Waschschritte à 10 Minuten in 1× PBS unter leichtem Schütteln während des Wartens.

Legen Sie Objektträger mit Mattglas in eine Wasserwanne, die tief genug ist, um die Gewebe nach dem Aufbringen auf die Objektträger zu bedecken. Zum Aufmontieren der Schnitte. Schneiden Sie zunächst die Membran mit einem Skalpell frei.

Zweitens übertragen Sie mit feinen Pinzetten bis zu fünf membranöse Schnitte auf jeden in Wasser getauchten Objektträger. Drittens entfernen Sie überschüssiges Wasser von jedem Objektträger. Viertens geben Sie einen Tropfen Eindecklösung auf jeden Gehirnschnitt.

Und schließlich vorsichtig ein Deckglas auf die Schnitte legen und eventuelle Luftblasen entfernen. Die Schnitte sind dann je nach Menge der elektroporierten DNA und dem embryonalen Entwicklungsstadium bereit für die Mikroskopie. Bei der Elektroporation wurde festgestellt, dass die Transfektionseffizienz variierte.

Acht Stunden nach der Transfektion mit einem P-Silencer begannen die GFP-Vektorzellen, GFP zu exprimieren. Während eines längeren Kultivierungszeitraums durchlaufen die Zellen eine normale Abfolge neurogener Ereignisse, einschließlich Proliferation, Migration und früher neuronaler Differenzierung. Diese Schnitte behielten ihre Morphologie fünf Tage lang bei, vorausgesetzt, die Medien-Luft-Interface wurde während des Durchführens dieses Verfahrens sorgfältig aufrechterhalten.

Es ist wichtig, das gesamte Experiment vom Zeitpunkt der Tötung des Tieres bis zum Einbringen der Schnitte in die Membraninserts innerhalb von zwei Stunden durchzuführen, um den Zelltod nach diesem Verfahren zu minimieren. Weitere Maßnahmen wie die Zugabe exogener Faktoren zur organotypischen Kultur können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Rolle verschiedene Wachstumsfaktoren oder pharmakologische Substanzen in den unterschiedlichen neurodevelopmentalen Mechanismen spielen.