In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie ein doppelt markierter DNA-Schadenssensor, der zwei Haupttypen von DNA-Strangbrüchen in Gewebeschnitten markiert, aufgebaut und verwendet wird. Der Sensor besteht aus einem 30 Tumor, einem DNA-Oligonukleotid, das doppelt mit ZI und Rumine markiert ist, sowie einem Enzym, Vaccinia-Topoisomerase I oder Vac-Topo, das sich selbst assembliert. Wenn Vac-Topo an den 30 Tumor bindet, beginnt der Maschinenbetrieb, wenn Topo is somnes das Oligonukleotid am drei-prim-Ende der Erkennungssequenz spaltet, wodurch eine Vac-Topo-aktivierter Fitzy-markierter Einheit und ein amine-markierter freier Haarnadelstrang entstehen.

Mit einem terminalen dreiprime Hydroxyl sind die Einheiten kurzlebig und werden schnell wieder zum ursprünglichen Konstrukt reassembliert, das anschließend gespalten wird. In Abwesenheit zusätzlicher extramolekularer DNA-Brüche trennen sich diese beiden Einheiten kontinuierlich und reaggregieren zyklisch. Wenn der molekulare Sensor auf Gewebeschnitte mit DNA-Schäden angewendet wird, bindet die mit Fitz markierte Detektoreinheit gezielt an stumpfe DNA-Enden mit Fünfprin-Hydroxyl.

Die mit dem R-Domänen-markierte Detektoreinheit ligiert an einen stumpfen, am 5'-Ende phosphorylierten Bruch. Wenn T4-DNA-Ligase vorhanden ist, erhält man Ergebnisse, die mittels Fluoreszenzmikroskopie die Präsenz und Verteilung von DNA-Einzelstrang- und Doppelstrangbrüchen in Zellen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Detektion von HESIs, wie beispielsweise TUNEL, liegt in ihrer höheren Spezifität und der zusätzlichen Information, die durch die Markierung sowohl der selbstautonomen als auch der phagozytotischen Phasen der Apoptose bereitgestellt wird.

Aus Sicht der Nanotechnologie ist der Sensor ein Beispiel für einen biologisch ermöglichten Ansatz, der tatsächlich vorkommende biologische Strukturen und Architekturen für die Herstellung nichttoxischer, molekularer Geräte nutzt. Im Allgemeinen könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da ihr Erfolg von der Verwendung einer hochaktiven Toro-SOM-Präparation und der korrekten Aufarbeitung der Schnitte abhängt, um eine Überverdauung durch Proteinase K zu vermeiden. Die Gewebeschnitte für dieses Verfahren sollten vor dem Zusammenbau des molekularen Geräts hergestellt werden. Fünf bis sechs Mikrometer dicke Schnitte, geschnitten aus Paraldehyd.

Fest eingebettete Paraffin-Gewebeproben werden empfohlen. Legen Sie den Objektträger mit dem Gewebeschnitt in einen Objektträgerbehälter und entfernen Sie das Paraffin mit Xylol für 15 Minuten. Nach 15 Minuten überführen Sie ihn in ein frisches Xylolbad für zusätzliche fünf Minuten.

Die Probe durch folgende stufenweise Ethanol-Konzentrationen rehydrieren: zweimal 96 % Ethanol je fünf Minuten, danach 80 % Ethanol fünf Minuten, gefolgt von Wasser.

Zweimal je fünf Minuten. Nach der Rehydratisierung die Schnittprobe mit Proteinase K verdauen. Verwenden Sie 100 Mikroliter einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Lösung pro Schnittprobe und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Je nach Gewebetyp muss möglicherweise die Verdauungszeit angepasst werden; achten Sie jedoch darauf, eine Überverdauung zu vermeiden, da diese zum Verschwinden des Signals und zur Zerstörung des Schnitts führen kann, sobald die Verdauung abgeschlossen ist.

Spülen Sie den Objektträger zweimal nacheinander je 10 Minuten mit destilliertem Wasser. Geben Sie 2 % BSA zur Vorblokierung zu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Während dieser Zeit montieren Sie die molekulare Maschine, wie im nächsten Teil dieses Videos gezeigt.

Alle Reagenzien zur Assemblierung der molekularen Maschine werden für ein Gesamtvolumen von 25 µL skaliert, was für eine einzelne Detektion in einem Gewebeschnitt mittlerer Größe ausreicht. Das Volumen kann bei Bedarf in einem kleinen Plastikröhrchen vergrößert werden. Geben Sie die folgenden Reagenzien in dieser Reihenfolge unter Zugabe von destilliertem Wasser zusammen.

15 % Polyethylenglykol 8.000, T4-DNA-Ligase-Puffer, doppelt markiertes Oligonukleotid, Vaccinia-Topoisomerase I und T4-DNA-Ligase werden vorsichtig per Pipettieren gemischt. Die molekulare Konstruktion fügt sich in dieser Lösung nahezu augenblicklich selbst zusammen und kann sofort bei Raumtemperatur verwendet werden. Um mit der Markierung von DNA-Strangbrüchen zu beginnen, saugt man die Vorblockierungslösung vom Objektträger ab.

25 µL der kompletten Reaktionsmischung auf jeden Schnitt geben. Einen Plastikdeckel über den Schnitt legen und die Probe in eine befeuchtete Kammer stellen. Die Kammer zur Lichtabschirmung mit Aluminiumfolie umwickeln und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Obwohl sowohl das Ligase- als auch das Topo-Signal nach der einstündigen Inkubation beobachtet werden können, lässt sich das Ligase-Signal in vielen Fällen weiter verstärken. Um das Signal zu verstärken, wird das Reaktionsgemisch erneut aufgetragen, jedoch ohne vac-Topo und Oligonukleotid eins, stattdessen mit Oligonukleotid drei und T4-DNA-Ligase. Anschließend wird ein Plastik-Deckglas auf den Schnitt gelegt und 18 Stunden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Am folgenden Tag wird der Objektträger bei Raumtemperatur vorsichtig senkrecht in ein Coplin-Gefäß mit Wasser bei Raumtemperatur getaucht, um das Deckglas zu entfernen.

Anschließend wird der Schnitt dreimal je 10 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen. Spülen Sie den Schnitt mit Natriumbicarbonat-Puffer. Diese alkalische Spülung verstärkt die fitzige Fluoreszenz, die pH-empfindlich ist und unter einem pH-Wert von sieben deutlich abnimmt.

Decken Sie den Schnitt abschließend mit einer Anti-Fading-Lösung ab, die zusätzlich DPI zur Gegenfärbung der Kerne enthält, und bringen Sie ein Deckglas auf. Die Schnitte sind nun bereit für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung. In dieser Abbildung ist ein Gewebeschnitt aus dem mit Dexamethason behandelten Thymus dargestellt, in dem die molekulare Maschinerie DNA-eins- und DNA-zwei-Typ-DNA-Strangbrüche mit stumpfen Enden in den kortikalen Thymusbereichen, die einer Apoptose unterliegen, nachgewiesen hat. Die grüne cytoplasmatische Fluoreszenz zeigt DNA-zwei-Typ-Strangbrüche an, sowie kortikale Makrophagen, die nukleäres Material apoptotischer Thymozyten verdauen.

Dieses Signal wird durch vac topo erzeugt und lokalisiert in FGA-Lysosomen mit DNA, die fünfprime Hydroxylgruppen enthält. Doppelstrangbrüche zeigen rote Fluoreszenz, die einen Bruchtyp der DNA markiert, Kerne apoptotischer Thymozyten, die nicht von Makrophagen phagozytiert wurden. Große Mengen von Thymozyten durchlaufen gleichzeitig die Apoptose.

Begleitet von der Bildung von Doppelstrangbrüchen mit fünfprimer Phosphatgruppe, die mittels ligasebasierten Markierungen sichtbar gemacht werden. Diese Brüche befinden sich am nukleären Rand und bilden ringförmige Muster. Alle zellulären Kerne sind durch Gegenfärbung mit dpi blau dargestellt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, niemals zuzulassen, dass die Schnitte zwischen der Zugabe unterschiedlicher Lösungen austrocknen. Bewahren Sie außerdem alle enzymatischen Präparationen vor der Zugabe der Schnitte auf Eis auf und schützen Sie Ihre fluoreszenten Sonden während der Markierungsreaktion nach deren Entwicklung vor Licht.

Dieser Sensor selbst ist ein Beispiel für den grünen Nanotechnik-Ansatz bei der Konstruktion von nanoskaligen Partikeln, Sonden und Maschinen. Dieser Ansatz kombiniert künstliche Komponenten mit natürlich vorkommenden molekularen Maschinenbauteilen. Ziel ist es, Toxizität und unerwünschte biologische Reaktivität dieser hochdispergierten Nanomaterialien auszuschließen.