Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Bestimmung der Zellviabilität in Zellen, die GFP mittels des tally-Bild-zellzählgeräts exprimieren. GFP-transduzierte Zellen werden mit dem tally-Vitalitätskit Dead Cell Red gefärbt, das alle toten Zellen mit Propidiumiodid rot anfärbt. Die Zellen werden in eine tally-Zellanalyse-Rutsche pipettiert und in das Zellzählgerät eingelegt, das Helligkeitsfeld- sowie rote und grüne Fluoreszenzbilder aufnimmt und analysiert. Anschließend werden Histogramme erstellt, um die Zellanzahl, Zellgröße, PI-Fluoreszenzintensität und GFP-Fluoreszenzintensität im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie darzustellen.

Tali kann ähnliche Daten zur Zellviabilität und Expression liefern. Diese bildbasierte Zytometrie bietet jedoch zusätzliche visuelle Informationen über die untersuchte Zellpopulation. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Durchflusszytometrie oder der Fluoreszenzmikroskopie liegt darin, dass der Tally-Bildzytometer gleichzeitig quantitative und visuelle Informationen zu Ihrer Zellprobe bereitstellt.

Außerdem ist das Zählinstrument einfacher zu bedienen, kostengünstiger und platzsparender als ein Durchflusszytometer oder ein Fluoreszenzmikroskop. Dadurch können Forscher quantitative Tests wie die Bestimmung der Vitalität in GFP-exprimierenden Zellen direkt am Laborplatz durchführen. In diesem Verfahren wurden U2-OS-Zellen mit einer Konzentration von einer mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter mit einem kernzielgerichteten CellLight GFP-Viruskonstrukt transduziert, um tote Zellen mit Propidiumiodid zu markieren; anschließend wurden 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Beachten Sie, dass für den Assay eine Konzentration von ein mal 10 hoch fünf bis ein mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter empfohlen wird, obwohl die Konzentration nicht exakt sein muss. Geben Sie anschließend ein Mikroliter Tally-Dead-Cell-Red-Reagenz hinzu. Vortexen Sie kurz, um die Lösung zu mischen, und inkubieren Sie das Färbe-Reagenz und die Zellmischung bei Raumtemperatur im Dunkeln für ein bis fünf Minuten.

Nach der Inkubation unverzüglich mit der Analyse auf dem bildbasierten Zählzytometer fortfahren. Für die Zählung werden speziell für das Gerät konzipierte Einweg-Kunststoffröhrchen für die Zellanalyse verwendet. Beim Einlegen des Objektträgers stets die Ränder halten.

Pipettieren Sie langsam 25 Mikroliter der Probe in einen der halbmondförmigen Probenauftragsbereiche. Hier werden ungefärbte, nicht transduzierte Kontrollzellen in Kammer A und die gefärbten, GFP-exprimierenden Zellen in Kammer B aufgetragen. Um einen Vitalitätsassay in GFP-exprimierenden Zellen durchzuführen, berühren Sie G-F-P-R-F-P auf dem Startbildschirm des Durchflusszytometers. Die Assay-Optionen erscheinen dann rechts; wählen Sie GFP plus Vitalität.

Das Gerät fragt anschließend, ob die Probenreihe benannt werden soll. Drücken Sie jetzt „Name“. Geben Sie dann mithilfe des Touchscreens den Namen der Probenreihe ein und drücken Sie „Speichern“. Das Tally-Cytometer wechselt automatisch zum Messbildschirm.

Danach, um die Hintergrundfluoreszenz zu messen, drücken Sie den Hintergrund-Tab in der unteren rechten Hälfte des Messbildschirms, wie hier zu sehen ist. Die Standardeinstellung zeigt an, dass neun Zellfelder abgebildet werden. Bringen Sie nun die Kontrollprobe von dem Instrument weggerichtet in die Ladeöffnung ein, bis sie anhält.

Üben Sie keinen Druck auf den Hintergrundbildschirm aus, um eine neue, ungefärbte Zellkontrolle einzuführen. Der Objektträger wird automatisch in das Gerät eingezogen, und ein Live-Bild der Zellen wird auf dem Bildschirm angezeigt. Bringen Sie mithilfe des Fokusknopfs die Zellen in die richtige Fokusebene, während Sie fokussieren.

Schieben Sie den roten Zoomknopf auf vier x oder 16 x. Um die Zellpopulation besser beurteilen zu können, sollten die Zellen einheitlich dunkel erscheinen mit einem hellen Hof um jede Zelle herum. Wie hier gezeigt, kann es vorkommen, dass Zellen unterzählt werden, wenn der Übergang zwischen dem Hintergrund und den Zellrändern unscharf ist und die Zellgrenzen daher nicht gut definiert sind.

Zellen können fälschlicherweise überzählt werden, wenn sie helle Zentren und dunkle Ränder aufweisen. Sobald die Zellen scharfgestellt sind, berühren und drücken Sie, um die Kontrolle für ungefärbte Zellen durchzuführen. Um die Hintergrundfluoreszenz zu messen, erfasst der Zytometer automatisch Bilder und zeigt Miniaturansichten jedes Sichtfelds an.

Die Fortschrittsanzeige liefert eine laufende Aktualisierung der Analyse. Nach Abschluss der Bildaufnahme stößt das Zytometer automatisch den Objektträger aus und stellt die Daten aus der Analyse der aufgenommenen Bilder bereit. Gespeicherte Daten werden im Dropdown-Menü des Hintergrundreiters angezeigt.

Die Hintergrundkontrollprobe erhält denselben Namen wie das Experiment. Um die mit PI gefärbte GFP-transduzierte Probe zu messen, nehmen Sie die Halterung aus dem Gerät, drehen Sie sie um und setzen Sie sie wieder ein, wobei die transduzierte Probe vom Gerät wegzeigt. Drücken Sie auf den Probentab und berühren Sie anschließend „Neue Probe einlegen“, um die Probe einzuführen.

Wenn das Bild auf dem Bildschirm erscheint, verwenden Sie den Fokusknopf, um die Zellen scharfzustellen. Berühren Sie anschließend wie zuvor, um die Probe zu analysieren. Nach Abschluss der Bildaufnahme erscheinen die Analyseergebnisse unter der Registerkarte Probe, und der Zytometer stößt den Objektträger automatisch ordnungsgemäß aus.

Entsorgen Sie den Zellanalyse-Objektträger als biohazardösen Abfall; diese Objektträger können nicht wiederverwendet werden. Nachdem die Probe analysiert wurde, können Schwellenwerte auf die Probe angewendet werden.

Um bestimmte Zellpopulationen zu analysieren, passen wir hier die Schwellenwerte an, um den Prozentsatz lebender und toter Zellen zu bestimmen. Bei GFP-exprimierenden Zellen unter dem Reiter „Sample“ werden die Anzahl und der Prozentsatz der GFP-exprimierenden lebenden Zellen, der GFP-exprimierenden toten Zellen, die Gesamtviabilität, die durchschnittliche Zellgröße, die gezählte Anzahl der Zellen sowie die Zellkonzentration angezeigt.

Des Weiteren werden am unteren Bildschirmrand Histogramme angezeigt, die Zellgröße, grüne Fluoreszenz und rote Fluoreszenz darstellen. Um das Zellgrößen-Tor zu setzen, berühren Sie die Miniaturansicht der Zellgröße, um das Zellgrößen-Histogramm zu öffnen und jegliches Trümmermaterial auszuschließen. Verschieben Sie die blauen Schieberegler, um sowohl große als auch kleine Ereignisse auszuschließen.

Berühren Sie, um die Zellen innerhalb der Gates einzuschließen. Berühren Sie als Nächstes die Miniaturansicht des GFP-Fluoreszenz-Histogramms, um es zur Analyse hinzuzufügen und zu öffnen.

Bewegen Sie den blauen Schieberegler, um die Schwelle direkt rechts neben dem schwächsten Peak einzustellen. Verwenden Sie die Kontrollprobe als Orientierung. Dadurch werden GFP-positive Zellen in die Analyse einbezogen, während autofluoreszierende Zellen ausgeschlossen werden.

Autofluoreszenz wird häufig beobachtet, wenn biologische Moleküle innerhalb von Zellen angeregt werden. Berühren Sie den Bildschirm, um zu bestätigen, und kehren Sie zum vorherigen Bildschirm zurück. Die unter dem Reiter „Probe“ angezeigten Daten sollten nun die für beide Fluoreszenzkanäle festgelegten Tore und Schwellenwerte widerspiegeln. Als Nächstes drücken Sie die Miniaturansicht des PI-Histogramms, um es erneut zu öffnen, und trennen so die mit PI gefärbten Zellen von der Autofluoreszenz oder jeglichem im Probenmaterial vorhandenen Hintergrund.

Der Peak der Kontrollprobe wird als grauer Peak im Histogramm angezeigt. Der rote Peak ist die Fluoreszenz der Probe. Die Hintergrundfluoreszenz wird als Peak dargestellt, der auf diesem Gerät dem Nullwert der RFU am nächsten liegt.

Um die Hintergrundfluoreszenz im PI-Kanal zu eliminieren, bewegen Sie den blauen Schieberegler, um die Schwelle anzupassen. Um diesen Peak auszuschließen, verwenden Sie den grauen Peak aus der Kontrollprobe als Referenz. Wenn die Schwelle im PI-Kanal korrekt eingestellt ist, berühren Sie „apply“, um zu bestätigen und zum vorherigen Bildschirm zurückzukehren. Das Zählinstrument analysiert die Daten erneut automatisch und aktualisiert die Ergebnisse im Reiter „sample“.

Danach, um visuell zu bestätigen, dass jede Zelle korrekt zugeordnet ist, drücken Sie die Zoom-Registerkarte und wählen Sie ein erfasstes Sichtfeld zur Überprüfung aus, indem Sie auf die Miniaturansicht des Bildes klicken. Drücken Sie dann die Registerkarte „Layers“. Danach drücken Sie die GFP- oder PI-Schaltfläche, um das über diesen Kanal aufgenommene Bild anzuzeigen.

Drücken Sie dieselbe Taste erneut, um die Ebene aus der Anzeige zu entfernen oder Ebenen zu überlagern. Berühren Sie die Tasten, die jedem Kanal entsprechen, um zu erkennen, wie die Zellen über einen bestimmten Kanal gezählt werden. Berühren Sie Kreise um die Zellen, die ausschließlich über den Hellfeldkanal gezählt wurden; Zellen, die keine Fluoreszenz zeigen, werden blau umkreist. Dies zeigt an, dass es sich bei einer bestimmten Zelle um lebende Zellen handelt, die im grünen Kanal exprimieren.

GFP wird in grünen Zellen, die im roten Kanal exprimieren, grün umkreist sein. Mit PI gefärbte Zellen werden rot umkreist und sind tote Zellen, die in beiden gezählt werden. Der rote und grüne Kanal wird gelb umkreist sein.

Dies zeigt an, dass die Zelle GFP exprimiert, aber zusätzlich mit PI gefärbt ist und daher tot ist. Gelegentlich erscheint ein schwarzer Kreis auf dem Bildschirm. Dies sind Objekte, die identifiziert wurden, jedoch aufgrund der Zellgröße von der Analyse ausgeschlossen wurden.

Setzen Sie die Feinabstimmung der Schwelle im Fluoreszenz-Histogramm mithilfe der gerade beschriebenen Schritte fort, bis jede Zelle, die Fluoreszenz zeigt, mit der entsprechenden Farbe umkreist ist. Alle Analyseparameter werden automatisch am Gerät gespeichert. Unter dem Daten-Tab.

Die Tally kann Datendateien von 500 Probendurchläufen speichern. Jede in der Datentabelle gespeicherte Datei steht für eine erneute Analyse zur Verfügung. Durch Auswahl der Datei in der Datentabelle wird diese erneut geöffnet, und alle Histogramme und Ebenen werden aktiviert, um Daten zu archivieren und Berichte zu erstellen.

Die in dem Gerät gespeicherten Daten können mithilfe eines USB-Sticks auf einen Computer übertragen werden. Vier repräsentative Zelltypen wurden mit einem kernzielgerichteten CellLight GFP-Viruskonstrukt transduziert, mit dem Tally-Vitalitätskit unter Verwendung des Dead-Cell-Red-Reagens gefärbt und anschließend mit dem Tally-System in einem Durchflusszytometer analysiert, wie hier gezeigt. Beide Methoden lieferten für jeden Zelltyp ungefähr denselben Prozentsatz an GFP-exprimierenden Zellen sowie den Prozentsatz an Zellen der Gesamtpopulation, die sowohl vital als auch GFP-exprimierend waren.

Diese Daten zeigen, dass der Tali-Zytometer in der Lage ist, zwischen der Gesamt-GFP-Expression in einer Population und der GFP-Expression in der lebenden Population zu unterscheiden. Wir haben soeben demonstriert, wie man den Tally-Bild-zu-Zytometer verwendet, um die Fluoreszenzexpression und Vitalität in Ihrer Zellprobe zu beurteilen. Diese Technologie schließt die Lücke zwischen Einzelzell- und Populationsstudien.

Mithilfe des tally-basierten Bildzytometers können quantitative und qualitative visuelle Informationen über einzelne Zellen sowie größere Zellpopulationen gesammelt werden. Mit demselben Verfahren lassen sich mehrere andere Assays durchführen, einschließlich Apoptose, RFP-Expression und Zellviabilität. Für nicht exprimierende Zellen umfassen die möglichen Anwendungen die Beurteilung der Genexpression bis hin zu Untersuchungen zur Wirksamkeit von Wirkstoffen.