Probenvorbereitung von

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, Mycobacterium tuberculosis mittels NMR-Metabolomik zu analysieren, zunächst eine Kultur anzusetzen und die Zellen in einem geeigneten Wachstumsstadium zu gewinnen. Anschließend werden die Zellen lysiert und zellfreie Extrakte für die Analyse gewonnen. Die lyophilisierten Extrakte werden in Puffer resuspendiert, um sie der NMR-Analyse zu unterziehen.

Abschließend werden NMR-Daten gesammelt und die Spektren mit Software zur Identifizierung von Metaboliten analysiert. Letztendlich dient die NMR-Analyse von Mycobacterium tuberculosis dazu, die Erhaltung von Metabolitspiegeln nach verschiedenen Behandlungen zu zeigen. Die NMR-Metabolomik kann auf wichtige Aspekte der Physiologie von Mycobacterium tuberculosis angewendet werden, beispielsweise auf bedeutende Stoffwechselwege.

Dieses Verständnis ist entscheidend, um die Wirkmechanismen von Arzneimitteln und Resistenzphänomene aufzuklären und neue Zielstrukturen für die Arzneimittelentwicklung zu identifizieren. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie nicht in der Lage sind, alle Proben exakt gleich zu behandeln, was unnötige Variabilitäten und Ergebnisse aus meinem Labor hervorrufen kann. Steven Luka, Doktorand, wird die Verfahren zur Probenvorbereitung für die NMR-Analyse aus meinem Labor demonstrieren. Der Laborleiter und Robert Fenton, wissenschaftlicher Techniker drei, werden nun die Verfahren zur Handhabung von Mycobacterium-tuberculosis-Kulturen bei der Arbeit mit M. tuberculosis demonstrieren.

Die Forschung erfolgte gemäß den Biosicherheitsstufe-drei-Praktiken, wie sie in den institutionellen Richtlinien definiert sind. Obwohl die Beschriftungen in diesem Video aus Gründen der Biosicherheit „Microbacterium tuberculosis“ angeben, wurde zur Demonstration der nicht-pathogene Mycobacterium magmatic verwendet. Beginnen Sie damit, eine 50 %ige Glycerin-Lagerkultur von M. tuberculosis auf Eis aufzutauen.

Inokulieren Sie 0,15 Milliliter in 110 Milliliter M-A-D-C-T-W-Brühe im 250-Milliliter-ER- und My-Fläschchen und kultivieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 100 U/min für etwa sechs Tage. Wenn keine Antibiotika, alternativen Zusätze oder andere Behandlungen erforderlich sind, ernten Sie die Kulturen, die Behandlungen benötigen.

Heben Sie 0,5 Milliliter Eloqua auf Eis für Kultur, Titration und Qualitätskontrolle auf. Führen Sie dann die gewünschte Behandlung durch und stellen Sie die Kulturen nach dem Behandlungszeitraum wieder in den Schüttler. Entnehmen Sie ein Milliliter und bestimmen Sie die OD 600.

Reservieren Sie außerdem eine 0,5-Milliliter-Probe für Kultur, Titration und Qualitätskontrolle. Halten Sie die Zellen während des gesamten restlichen Protokolls auf Eis. Gewinnen Sie die Zellen in vier 50-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation, nachdem Sie sie mit 15 Milliliter eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser gewaschen haben.

Resuspendieren Sie die Pellets in 10 Milliliter-Aliquoten. Entnehmen Sie zwei Aliquote und pelletieren Sie durch Zentrifugation, anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Endvolumen von einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser. Wenn eine Einzelzell-Suspension frei von Agglomerationen gewünscht ist, lassen Sie die Zellen durch eine 27-Gauge-Nadel passieren.

Dreimal die ein Milliliter Zellsuspension in ein zwei Milliliter Schraubverschlussröhrchen mit Lysiermatrix B überführen. Den FastPrep-24-Lysator im Sicherheitswerkbankgehäuse positionieren. Die Proben in den Probenträger einsetzen und die Haltegriffplatte fixieren. Anschließend 60 Sekunden bei einer Geschwindigkeitseinstellung von sechs Metern pro Sekunde bearbeiten.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben, um Zelltrümmer und intakte Zellen zu pelletieren. Danach filtrieren Sie das Überstand durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter in ein steriles Gefäß, um sicherzustellen, dass keine lebensfähigen Zellen vorhanden sind. Impfen Sie 0,1 Milliliter der Probe auf MADC.Agar aus.

Gefrieren Sie die Proben in einem Ethanol-Trockeneis-Bad ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie lyophilisiert und in einer NMR-Einrichtung verarbeitet werden können. Nach zwei Monaten überprüfen Sie die Platten, um das Fehlen koloniebildender Einheiten zu bestätigen. Wenn keine koloniebildenden Einheiten gefunden werden, können die Proben aus dem BSL-3-Labor zur weiteren Analyse in einer Standard-NMR-Einrichtung entfernt werden.

Nachdem die Proben bis zur Trockne eingeengt wurden, in 0,7 Milliliter NMR-Puffer resuspendieren und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Drei Minuten bei 13.000 × g zentrifugieren, 0,6 Milliliter abnehmen und in eine 5-Millimeter-NMR-Röhre überführen. Für die Analyse aus Kulturmedien ermöglicht ein speziell angefertigter Halter das einfache Beladen mehrerer NMR-Röhren in die Rotoren auf der korrekten Tiefe.

Überführen Sie die Proben anschließend in den NMR-Spektrometer, um sie nacheinander in den 20-Proben-Wechsler A-B-A-C-S einzusetzen, wobei unbehandelte und mit Wirkstoff behandelte Kulturen abgewechselt werden. Die erste Probe muss zu Beginn eines automatisierten Laufs bereits im Magnet vorgeladen sein.

Um das Instrument zu kalibrieren, optimieren Sie die 90-Grad-Impulslänge mit einer einzelnen Probe und stimmen Sie das Instrument für die verbleibenden Proben ab. Verwenden Sie das Symbol NMR und grad shim. Automatisieren Sie das Verriegeln, Abschirmen und die NMR-Datenerfassung für jede Probe.

Für ein eindimensionales Wasserstoff-NMR-Spektrum wählen Sie die Pulsserie mit Wassersuppression und Excitation Sculpting aus. Stellen Sie insgesamt 32.000 Datenpunkte, 128 Scans und 16 Dummy-Scans für ein zweidimensionales 1H-13C-HSQC-Spektrum ein. Wählen Sie die Pulsserie aus.

Wählen Sie insgesamt 2048 Datenpunkte mit einer Sweep-Breite entlang der direkten H-Eindimensionalität und 64 Datenpunkte mit einer Sweep-Breite entlang der indirekten C-13-Dimensionalität aus. Legen Sie außerdem die Spektrumsaufnahme mit 128 Scans und 16 Dummy-Scans fest, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Ein Spektrum von m tuberculosis ergab ungefähr 400 Signale, darunter 50 bekannte Metaboliten.

Beispielsweise ergab die Datenverarbeitung gemäß dem begleitenden Manuskript dieses Spektrum an Metaboliten, die direkt oder indirekt mit dem D-Alanin-Stoffwechselweg assoziiert sind. Die Größe der Peakintensitäten ist proportional zu den Konzentrationen der Metaboliten im Zellextrakt, sodass relative Störungen von Metaboliten und Stoffwechselwegen zwischen Proben und Behandlungen quantifiziert werden können. Die LMR-Metabolomik eröffnet Forschenden auf dem Gebiet der Bakteriologie neue Möglichkeiten, die Physiologie und Pathogenese von Mikroorganismen – pathogenen oder nicht pathogenen – visuell zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehrere Tuberkulose-Zellextrakte für die NMR-Metabolomik vorbereitet, und vor allem die Konsistenz während des gesamten Protokolls beibehält, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.