Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die zytotoxische T-Zell-Aktivität zu bestimmen, indem ein impedanzbasiertes Verfahren mit dem EXOGEN-System mit dem Chromfreisetzungsassay verglichen wird. Der erste Schritt erfolgt durch die Isolierung peripherer mononuklearer Blutzellen aus Vollblut unter Verwendung von Fial. Anschließend werden die PBMC zusammen mit peptidischen Antigenen, humanem rekombinantem IL-2 und bestrahlten PBMC in die Vertiefungen gegeben, um antigenspezifische CD8+-T-Zellen zu erzeugen.

Die antigenspezifischen CD8+-T-Zellen werden anschließend in beiden Assays mit Tumorzellen koinkubiert, um den Tod der Tumorzellen zu verursachen. Die Ergebnisse zeigen den Prozentsatz der Lyse der Tumorzellen, ermittelt mittels der Impedanzmethode und des Chromfreisetzungstests. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie dem Chromfreisetzungstest besteht darin, dass das impedanzbasierte System Echtzeitdaten erfasst und weniger Zellen benötigt, die keiner Markierung bedürfen. Für dieses Protokoll liefert Blut von gesunden, HLA-A2-positiven Spendern eine Quelle für PBMCs (periphere mononukleäre Blutzellen) gemäß der Anleitung des Herstellers.

Verwenden Sie F call PA plus, um die P-BMCs aus dem Blut zu isolieren. Anschließend geben Sie etwa 4 Millionen P-BMCs in zwei Milliliter Medium pro Vertiefung in eine sechswellige Platte. Geben Sie jedem Brunnen HLAA-2-Bindungspeptid hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter Kultur zu erreichen.

Die Zellen an abwechselnden Tagen, um T-Zellen zu stimulieren und zu expandieren. Frisches Medium zugeben, das mit humanem rekombinantem IL-2 supplementiert ist, um eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter zu erreichen. Nach einer Woche eine Kultur autologer PBMCs vorbereiten, die Zellen bestrahlen und sie zwei Stunden lang mit dem gleichen HLA pulsieren lassen.

Ein zwei Bindungs-Peptid in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter stimuliert die Kultur erneut, indem ein Milliliter der bestrahlten autologen PBM CS zu jedem Ansatz gegeben wird. Fügen Sie weiterhin alle zwei Tage frisches Medium, das mit IL-2 ergänzt ist, hinzu. Nach einer weiteren Woche stimulieren Sie die Kulturen auf dieselbe Weise ein zweites Mal. Nach weiteren sechs Tagen im Kulturansatz sind die Zellen gebrauchsfertig.

Bereiten Sie die Impedanz-Messstation für die Anwendung vor, indem Sie sie mindestens eine Stunde lang unter 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius äquilibrieren. Gewinnen Sie humane Tumorzellen mit 75 % Konfluenz mithilfe von 0,25 % Trypsin und Zentrifugation. Zählen Sie die Tumorzellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren Sie sie in RPMI.

Tumor-Medium mit einer Konzentration von 7.500 Zellen pro Mikroliter. Im nächsten Schritt richtet die Excel-Agenten-Software die Layout-Seite mit der Wells-Anordnung ein. Richten Sie die Zeitplan-Seite so ein, dass alle fünf Minuten über einen Zeitraum von 40 Stunden Impedanzmessungen durchgeführt werden. Für die ersten 18 Stunden führt das Xceligent-System lediglich Impedanzmessungen der Tumorzellen durch.

Dann 100 Mikroliter RPMI-Tumor-Medium pro Vertiefung hinzufügen. Eine Hintergrundmessung an den EPLs vornehmen, indem die Impedanz in Abwesenheit von Zellen gemessen wird. Nachdem die Tumorzellen hinzugefügt wurden, die Platten in die Station laden und mit der Aufnahme von Messwerten beginnen.

Die Tumorzellen beginnen unmittelbar mit der Adhäsion an die EPLs. Nach einer Inkubation von etwa 18 Stunden haben sich die Tumorzellen an die EPLs angeheftet und sich auf 15.000 Tumorzellen pro Mulde verdoppelt. Zu diesem Zeitpunkt werden die vorbereiteten T-Zellen durch vorsichtiges Abkratzen und Zentrifugation unter Schütteln gewonnen.

Die T-Zellen in RPMI-Medium mit 10 % FBS resuspendieren und mit einem Hämozytometer zählen. Sobald die Zelldichte bekannt ist, eine Verdünnungsreihe der T-Zellen im Verhältnis 1:2 herstellen, sodass beim Hinzufügen von 200 Mikrolitern T-Zellen zu den Tumorzellen die höchste Konzentration 40 T-Zellen pro Tumorzelle beträgt. Die letzte Verdünnung der Reihe sollte 1,25 T-Zellen pro Tumorzelle ergeben.

Pausieren Sie die EXOGEN-Station und entfernen Sie das EPL mit einer Pipette. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und geben Sie dann 200 Mikroliter T-Zellen mit allen Konzentrationen aus der Verdünnungsreihe als Negativkontrolle hinzu. Verwenden Sie reines Medium, stellen Sie das EPL anschließend wieder in die Station zurück und setzen Sie das Programm am Ende des Assays fort.

Normalisieren Sie die Ergebnisse. Befolgen Sie stets die strahlenschutzrechtlichen Vorschriften der Institution, wenn Sie mit Chrom 51 und mit Chrom 51 markierten Zielzellen arbeiten, und verwenden Sie Abschirmungen, um die Strahlenexposition zu reduzieren. Beginnen Sie damit, Tumorzellen für zwei Stunden bei einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter mit 10 Mikrolitern pro Milliliter frischem Chrom 51 zu belasten.

Als Nächstes waschen Sie die Tumorzellen in 10 Milliliter RPMI-Medium mit 10 % FBS, zentrifugieren die Zellen und resuspendieren sie in dem gleichen Medium auf eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann 100.000 Tumorzellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Rundbodenplatte, um die spontane Freisetzung zu bestimmen.

Fügen Sie nichts zu sechs dieser Vertiefungen hinzu, sondern zu sechs anderen Vertiefungen. Geben Sie 100 Mikroliter Triton X-100 hinzu, um die Zellen zu lysieren und somit die maximale Freisetzung in alle verbleibenden Vertiefungen zu berechnen. Geben Sie T-Zellen in die Platte, indem Sie die zuvor vorbereitete Verdünnungsreihe verwenden.

Jetzt die Platten fünf Stunden inkubieren und 50 Mikroliter Proben des Überstandes von jeder Vertiefung entnehmen; laden Sie die Proben nach dem Trocknen der Platten über Nacht bei Raumtemperatur im Abzug auf eine Luma-Platte auf. Messen Sie deren CPM mit einem Gammazähler T-Zelle und SKBR drei. Krebszellen wurden auf X-Intelligenz-Platten kultiviert, und der Zellindex wurde gemessen, der eine Reflexion der Plattenimpedanz darstellt, da T-Zellen keine Anheftung zur Proliferation benötigen.

Ihr Einfluss auf die Impedanz war über eine 40-stündige Kultur hinweg vernachlässigbar. Krebszellen, die allein kultiviert wurden, zeigten eine zunehmende Impedanzmessung. Die Zugabe von T-Zellen nach 18 Stunden unterbricht jedoch diesen Trend.

Dieses Ereignis erfordert eine Software-Normalisierung nach der Zugabe von T-Zellen und wird im nächsten Experiment weiter untersucht. Wenn SK-BR-3-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von T-Zellen koinkubiert wurden, waren die Abnahmen der Impedanz sehr deutlich dosisabhängig; die Daten wurden im Zehn-Stunden-Zeitraum über drei Versuche hinweg alle fünf Minuten erfasst. Die Zellindizes folgten über den Bereich der T-Zellen hinweg einem Polynom zweiter Ordnung, was darauf hindeutet, dass die Exogen-Station den CD8-T-Zell-vermittelten Zelltod von SK-BR-3-Tumoren in Echtzeit als Abnahme des Zellindex überwacht, um zu bestimmen, ob die Impedanzabnahmen von SK-BR-3 durch die T-Zellen antigenspezifisch sind.

SK-KBR-Dreierzellen wurden zusammen mit HLA-A2-positiven, FLU-spezifischen T-Zellen kultiviert, die HER2/neu nicht erkennen. Diese Zellen wiesen eine signifikant geringere lytische Aktivität auf. Um weiter zu untersuchen, ob die HER2/neu-spezifischen T-Zellen auf antigenspezifische Weise töten, wurde ein Antikörper gegen das Fas-Ligand in die Koinkubationen eingefügt. Der Antikörper verringerte die lytische Aktivität der HER2/neu-P360-9-spezifischen T-Zellen nicht.

Jedoch bei T-Zellen, die unspezifisch mit Anti-CD3-, CD28-Perlen aktiviert wurden, hemmte der Antikörper die Lyse, um zu bestimmen, ob die Zerstörung auf HLA-Klasse-I-abhängige Weise erfolgte. Entweder ein Anti-HLA-Klasse-I-Antikörper oder ein Isotyp-Kontrollantikörper wurden den Kokulturen hinzugefügt. Die Ergebnisse unterstützten diese Hypothese stark.

T-Zellen wurden anschließend im Verhältnis eins zu fünf mit anderen Krebszellen koinkubiert. Die HLA-A2-negative Tumorzelllinie BT-20 diente als negativer Kontrollstamm. Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode für mehrere Ziel-adhärente Tumorzellen geeignet ist.

Kokulturen der HER2-spezifischen T-Zellen P360.9 wurden zu mit Chrom-51 markierten Zielzellen hinzugefügt, gefolgt von einer CRA-Analyse. Der Intelligenztest scheint empfindlicher, um die Konsistenz zu analysieren. Die intraassay-Variation wurde als prozentualer Variationskoeffizient bei jedem Zellverhältnis zwischen 1:40 und 1:5 berechnet.

Dieser Wert lag bei den niedrigsten Zellverhältnissen unter 15 %. Allerdings war der prozentuale CV hoch oder unvorhersehbar. Zusätzlich wurde die Variabilität der SK BR drei-vermittelten T-Zelllyse durch Ko-Kultur mit verschiedenen P 360 9-spezifischen T-Zelllinien untersucht.

Die Daten wurden 30 Tage auseinander generiert. Die Assays wurden im Dreifachansatz durchgeführt und zeigten sehr ähnliche Ergebnisse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die zytotoxische T-Zell-Aktivität unter Verwendung antigenspezifischer CD8-T-Zellen und Tumorzellen mithilfe eines impedanzbasierten Ansatzes bestimmen kann.