Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf den sich entwickelnden Zebrafisch zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Zebrafische zunächst während der frühen Entwicklung in normalem Embryowasser Ethanol in bestimmten Dosen ausgesetzt werden. Anschließend wird das Ethanol entfernt, und die Fische dürfen bis zum gewünschten Zeitpunkt weiterentwickeln.

Dann werden sowohl grobe physikalische Veränderungen als auch Änderungen in der Genexpression in behandelten im Vergleich zu Kontrollembryonen analysiert. Schließlich werden die Embryonen mit mRNA, Morpholinos oder Wirkstoffen manipuliert, um festzustellen, ob die durch Ethanol hervorgerufenen Entwicklungsdefekte verändert werden können. Letztendlich zeigen eine Kombination aus quantitativer PCR und *in situ*-Hybridisierung, dass die Wirkungen von Ethanol auf sich entwickelnde Zebrafisch-Embryonen mit Veränderungen in der Genexpression verknüpft sind.

Spätere Eingriffe in die Genexpression können die durch Ethanol verursachten Entwicklungsstörungen verbessern oder verhindern. Die heute gezeigten Techniken erweitern unser Wissen über die Natur des fetalen Alkoholsyndroms sowie über konservierte Entwicklungsprozesse bei Wirbeltieren. Die Behandlung von Embryonen mit Ethanol wird heute von Steph Erhardt, einer Technikerin in meinem Labor, demonstriert.

Züchten Sie sie durch Kreuzung von Wildtypen bis zum Kuppelstadium bei 28 Grad Celsius in Embryowasser. Verteilen Sie die Embryonen einer Gelege auf die gewünschte Anzahl von Schalen mit jeweils zwischen 10 und 50 Embryonen pro Schale. Geben Sie eine Ethanol-Lösung im Bereich von 0,2 bis 2,5 % (Volumen pro Volumen) in Fischwasser zu den Embryonen hinzu und kehren Sie sie nach der gewünschten Expositionszeit für bis zu 24 Stunden in den Inkubator zurück.

Ersetzen Sie das Ethanol enthaltende Wasser durch frisches Embryowasser für einen bestimmten Entwicklungszeitraum, um mRNA für die quantitative PCR zu gewinnen. Geben Sie H-kompatible Embryonen in Eppendorf-Röhrchen. Entfernen Sie das Fischwasser und geben Sie Lysepuffer mit TCEP hinzu.

Unter Verwendung eines motorbetriebenen Pulverisierers die Embryonen mechanisch dissoziieren und anschließend für eine langsame Zentrifugation in die Zentrifuge geben. Das Lösungsmittel auf eine Vorklärsäule übertragen und danach die Säule zentrifugieren, um dissoziierte große Partikel zu entfernen.

Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit, um die RNA zu extrahieren. Anschließend synthetisieren Sie cDNA mit Standardmethoden für die qPCR- oder Microarray-Analyse, um Embryonen für die *in situ*-Hybridisierung und Antikörperfärbung vorzubereiten. Fixieren Sie Embryonen sechs bis 24 Stunden nach der Befruchtung über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius, nach drei Waschschritten mit PBS plus 0,1 % Tween.

Entfernen Sie die Chorionhülle mit zwei scharfen Pinzetten unter dem Mikroskop. Anschließend überführen Sie die Embryonen in Methanol, indem Sie die Flüssigkeit schrittweise mit zunehmender Methanol-Konzentration und abnehmender PBT-Konzentration wechseln. Nach dem Übertragen der Embryonen in 100 % Methanol lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, um den Knorpel anzufärben.

Züchten Sie die Embryonen bis zu fünf oder sechs Tage nach der Befruchtung. Fixieren Sie sie über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Waschen Sie sie anschließend dreimal in PBT, um zu bestimmen, welche Genexpressionsniveaus sich durch Ethanol-Behandlung verändert haben.

Führen Sie eine QPCR durch, indem Sie zunächst Primer entwerfen, um die Primer zu validieren. Testen Sie diese an drei biologischen Proben. Diese kontrollierten biologischen Proben können beliebiges Alter aufweisen, solange das Gen von Interesse zu diesem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird.

Nachdem die Primer verifiziert wurden, verwenden Sie die zuvor hergestellte cDNA, um eine qPCR durchzuführen, wobei die Proben im Dreifachansatz laufen und eine Kontrollprobe für einen Zebrafisch-Kontrollwert eingeschlossen wird; wir verwenden die Primer für gap dh. Normalisieren Sie die Ergebnisse auf die gap DH-Spiegel. Berechnen Sie anschließend die relative Genexpressionsmenge unter Verwendung der leistungsstarken Methode.

Variation der doppelten Delta-Delta-CT-Methode zur Darstellung der Unterschiede im Experiment im Vergleich zum Wildtyp. Für den Zwei-Hybridisierungs-Konstrukt in C. Verwenden Sie markierte Ribo-Proben für das Gen von Interesse.

Dann inkubieren Sie sie unter Standardbedingungen mit altersentsprechenden Embryonen und detektieren Sie das Hybridisierungsmuster mittels alkalischer Phosphatase; nehmen Sie die Proben mit einem Stereomikroskop auf, um die morphogenetische Entwicklung zu beurteilen, beispielsweise könnte die Form verwendet werden, um lebende Embryonen abzubilden und den interokularen Abstand sowie die Körperlänge zu bewerten. Fixieren Sie zunächst die Embryonen in Paraformaldehyd. Sammeln Sie anschließend Bilder, um die Auswirkungen der Alkoholbehandlung auf die sich entwickelnden Knorpelstrukturen in der Larvenfärbung zu untersuchen.

Fixieren Sie Zebrabärblinge mit LC und Blau für mehrere Stunden bis über Nacht, um die Embryonen vor der Bildgebung zu fixieren und zu klären. Analysieren Sie den Zelltod in lebenden Embryonen, indem Sie diese eine Stunde lang in fünf Milligramm pro Milliliter Aine Orange in PBS inkubieren. Waschen Sie die Embryonen dreimal in PBS, montieren Sie die Embryonen anschließend auf Objektträgern, nehmen Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop auf und verwenden Sie Z-Serien, um Komposite zu erstellen.

Nach der Identifizierung von Genen, deren Expression aufgrund der Exposition gegenüber Ethanol abgenommen hat, injizieren Sie 25 bis 200 Pikogramm pro Nanoliter kapptes mRNA eines Gens von Interesse in Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium. Lassen Sie die Eier in einem beheizten Inkubator bei 28 Grad Celsius so lange regenerieren, bis sie das Dommoment erreichen, und behandeln Sie sie anschließend wie zuvor mit Ethanol. Für Gene, deren Expression infolge der Ethanolbehandlung angestiegen ist, führen Sie eine Herunterregulation durch Injektion von Pikogramm- bis Nanogramm-Mengen von antisense-Morpholinos in Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium durch.

Dieses Protokoll ähnelt dem für kappte mRNA. Falls eine mRNA oder ein Spleiß-Morpholino injiziert wird, messen Sie die Effizienz mittels RT-PCR, um die Mengen gespleißter und ungereifter Transkripte zu vergleichen, um die genetische Aktivität in Abhängigkeit von der Dosis zu analysieren, titrieren Sie das injizierte Morpholino und lassen Sie die Embryonen bis zu einem gewünschten Entwicklungsstadium wachsen, bevor Sie sie mit Ethanol behandeln. Die Exposition von Zebrafisch-Embryonen gegenüber Ethanol führt zu einer Reihe von Entwicklungs- und genetischen Defekten, die mit den Phänotypen verwandt sind, die bei anderen Wirbeltieren beobachtet werden.

Die abnormale Entwicklung der axialen Gewebe, einschließlich Noor, führt zu einer verkürzten und gelegentlich unterbrochenen noord, was teilweise die späteren Anomalien in den Somiten verursacht, wie hier gezeigt. Während die unbehandelten Kontrollen eine ausgeprägte Pfeilform aufweisen, nehmen die durch Ethanol behandelten Somiten die U-förmige Gestalt an, die mit einer verminderten sonic hedgehog-Signalübertragung assoziiert ist. Wie hier zu sehen ist.

Eine weitere Folge der Ethanol-Exposition, möglicherweise abhängig von einer frühen Entwicklungshemmung und nachfolgenden Noor-Defekten, ist eine verkürzte Embryolänge. Dieser Befund ähnelt der Persistenz einer vorpubertären Kleinwüchsigkeit bei Kindern, die während der Entwicklung Ethanol ausgesetzt waren, was darauf hindeutet, dass das Zebrafisch-Modell für das Verständnis dieses menschlichen Geburtsfehlers relevant ist. An Tiermodellen wurde gezeigt, dass eine schwere Ethanol-Exposition zu ausgeprägten Phänotypen des fetalen Alkoholsyndroms führt, einschließlich Synchie und Opie.

Bei Zebrafischen nimmt der intraokulare Abstand (IOD) in Abhängigkeit von der Ethanoldosis ab, was mit der Natur des menschlichen Geburtsdefekts übereinstimmt. Opia tritt nur bei sehr hohen Dosen auf, doch bereits niedrigere Dosen führen zu einer signifikanten Verringerung des IOD, was darauf hindeutet, dass dieses Tiermodell einen ähnlichen Defekt in der Mittellinien-Entwicklung des Gesichts aufweist. In dieser Abbildung werden die Expressionslevel der frühen Gene sechs drei B und glee eins in unbehandelten und mit Ethanol behandelten Embryonen verglichen.

Beide Gene zeigten in den mit Ethanol behandelten Proben verringerte Expressionsmengen. Mithilfe der NC-Zwei-Hybridisierung wurden die Expressionsmuster von sechs drei B und gooID wie dargestellt analysiert. Hier zeigten beide Gene eine Abnahme der räumlichen Expression in mit Ethanol behandelten Embryonen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen.

Da beide Gene in Geweben exprimiert werden, die zu kraniofazialen Mittellinienstrukturen werden sollen, ist ihre Verringerung acht Stunden nach der Befruchtung vereinbar mit der späteren Entwicklung einer verminderten IOD. Sobald Gene identifiziert sind, die durch Ethanol beeinflusst werden, gibt es Mechanismen, durch die ihre Expression erhöht oder verringert werden kann. In diesem Beispiel wurde mRNA für sonic hedgehog injiziert, einen Liganden, der die Glee-one-Spiegel erhöht, wodurch die groben Defekte infolge der Verringerung von Glee one sowie die Defekte bei mit Ethanol behandelten Embryonen behoben wurden.

Die Injektion von sechs drei B konnte jedoch das durch Ethanol hervorgerufene Phänotyp nicht retten. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man genetische und entwicklungsmäßige Defekte untersucht, die durch Ethanol in einem sich entwickelnden Zebrafischembryo verursacht werden. Die hier verwendeten Techniken können ebenfalls von Personen angewendet werden, die die Toxizität anderer wasserlöslicher Verbindungen am sich entwickelnden Wirbeltierembryo untersuchen möchten.