Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anwendung eines Lateral-Flow-Geräts zur schnellen Nachweisung des diagnostischen Antigens von Aspergillus in menschlichem Serum und BAL-Flüssigkeiten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Serum- oder BAL-Probe auf die Freigabebuchse des Lateral-Flow-Geräts aufgetragen wird. Der zweite Schritt besteht darin, der Lösung zu ermöglichen, entlang der Membran zu wandern.

Der nächste Schritt besteht darin, die Gültigkeit des Tests durch Untersuchung der internen Kontrolllinie zu überprüfen. Der letzte Schritt ist die Interpretation des Testergebnisses durch Untersuchung der Testlinie. Letztendlich dient das Lateralfluss-Testsystem zum Nachweis des diagnostischen Antigens von Aspergillus in Serum- oder BAL-Flüssigkeiten.

Der Aspergillus-LFD kann als ergänzender Test zur Diagnose einer invasiven pulmonalen Aspergillose verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie dem Aspergillus-Galacto-Mannan-Enzymimmunoassay, dem Panf- und Fundal-Beta-Glucan-Assay sowie dem Aspergillus-PCR-Test besteht darin, dass es sich um einen schnellen, am Versorgungsort durchführbaren Diagnosetests handelt, der minimale Laborausrüstung und geringe Schulungsanforderungen benötigt. Obwohl der LFD zur Detektion von Aspergillus-Arten entwickelt wurde, kann die Lateralfluss-Technologie auch zur Nachweisung anderer infektiöser Pathogene wie Cetosporium-, Fusarium- und Riser-Arten eingesetzt werden.

Durch die Verwendung monoklonaler Antikörper, die spezifisch für diese Organismen sind, ist die visuelle Darstellung dieser Methode entscheidend. Da die Interpretation der LFD-Ergebnisse eine Vertrautheit mit dem Testformat erfordert, sollten Serum- und Bronchoalveoläre Lavage- (BAL-)Flüssigkeiten nach der Gewinnung aus unbehandelten Blutproben, bei denen das Blut bei vier Grad Celsius gerinnen darf, als Aliquots bei minus 20 Grad Celsius vor der Verwendung gelagert werden. Die Lagerung als Aliquots begrenzt das Potenzial für den Abbau des Zielantigens durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben während wiederholter Tests. Um Serum- und BAL-Proben für die Analyse vorzubereiten, tauen Sie die Proben bei Raumtemperatur auf und stellen Sie sie anschließend auf Eis. Mischen Sie gründlich durch Vortexen und zentrifugieren Sie dann eine Minute bei 14.000 U/min. Für den routinemäßigen Test menschlicher Proben verdünnen Sie das Serum im Verhältnis 1:1 mit Zellkulturmedium. Alternativ, um das Zielantigen von serumgebundenen Immunkomplexen abzulösen, verdünnen Sie das Serum 1:2 mit PBS, das 4 % EDTA enthält, erhitzen Sie drei Minuten im siedenden Wasserbad und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 14.000 U/min.

Menschliche BAL-Flüssigkeiten erfordern keine Vorbehandlungen. Eine BAL-Probe wurde aufgetaut, vortexiert und zentrifugiert, was eine klare Probe ergibt, die direkt auf das Lateral-Flow-Gerät aufgetragen werden kann. Zum Testen werden die Lateral-Flow-Geräte (LFD) bei Raumtemperatur oder 23 °C gelagert, bei der sie 12 Monate stabil sind.

Um den Test zu beginnen, nehmen Sie die Geräte aus ihren Beuteln und stellen Sie sie auf eine ebene Fläche. Geben Sie mithilfe einer sterilen Pipettenspitze innerhalb von Sekunden 100 Mikroliter vorbehandeltes Serum in die Freigabebuchse des Geräts. Die Flüssigkeit sollte durch Kapillarwirkung entlang der nitrocellulosehaltigen Membran im Beobachtungsfenster wandern.

Auf dieselbe Weise 100 Mikroliter einer unverdünnten BAL-Probe auf die Freisetzungsöffnung des Geräts auftragen. Den Assay 15 Minuten bei Raumtemperatur laufen lassen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Testergebnisse aufgezeichnet werden sollten. Der Test sollte nicht länger als 15 Minuten vor der Aufzeichnung der Ergebnisse belassen werden.

Da dies die Ergebnisinterpretation verfälschen könnte, wird eine schwache Reaktion nicht durch eine Verlängerung der Inkubationszeit verstärkt. Der LFD besteht aus einer Kontrolllinie, die durch den Buchstaben C auf dem Kunststoffgehäuse gekennzeichnet ist, und einer Testlinie, die durch den Buchstaben T gekennzeichnet ist. Die Kontrolllinie sollte unabhängig vom Vorhandensein von Aspergillus-Antigen in der Serum- oder BAL-Probe immer erscheinen. Dies zeigt an, dass der Test ordnungsgemäß durchgelaufen ist, falls Aspergillus-Antigen in der Serum- oder BAL-Probe vorhanden ist.

Die Testlinie erscheint ebenfalls innerhalb von 15 Minuten nach der Probenapplikation. Die Intensitäten der Test- und Lyme-Reaktionen stehen in proportionalem Verhältnis zu den Konzentrationen des Zielantigens in den Serum- und VAL-Proben. Der anspruchsvollste Aspekt dieses Verfahrens ist die Interpretation der Testergebnisse.

Die LFD-Ergebnisse sollten nach 15 Minuten abgelesen und mit dem hier gezeigten repräsentativen Beispiel verglichen werden. In dieser Abbildung sind repräsentative Beispiele für schwache, positive, mäßig positive und stark positive LFD-Ergebnisse mit BAL- und Serumproben dargestellt. Jede positive Testlinie in der Serumprobe, unabhängig von ihrer Intensität, weist auf eine invasive Pary-Aspergillose oder IPA-Erkrankung hin, da zirkulierendes Aspergillus-Antigen im Blutkreislauf vorliegt. Positive BAL-Reaktionen, unabhängig von ihrer Intensität, weisen auf die Keimung von Sporen und die Entwicklung potenziell pathogener Hyphen in der Lunge hin.

Bei Abwesenheit von Aspergillus-Antigen erscheint keine Testlinie, und das Ergebnis wird als negativ dokumentiert. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse von LFD-Tests unter Verwendung von BAL-Flüssigkeiten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder einer ML-Diagnose, die gemäß den diagnostischen Kriterien der European Organization for Research and Treatment of Cancer und der National Institute of Allergy and Infectious Diseases Study Group gestellt wurde. In diese Tabelle sind die entsprechenden klinischen und psychologischen Daten sowie die Ergebnisse eines ASPERIA-spezifischen PCR-Tests für jeden Patienten aufgenommen.

Gemäß den E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien von 2002 erhielten die Patienten 12, 13 und 16 die Diagnose einer möglichen invasiven pulmonalen Aspergillose (IPA) basierend auf Wirtsfaktoren sowie klinischen Kriterien oder GM-Positivität. Laut den überarbeiteten E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien von 2008 würden alleinige Wirtsfaktoren mit GM-Positivität oder alleinige Wirtsfaktoren mit klinischen Kriterien nicht ausreichen, um eine mögliche invasive Pilzinfektion anzudeuten, sofern nicht jeweils unterstützende Hinweise aus klinischen Daten beziehungsweise der Mykologie vorliegen. Patient sechs erhielt sowohl nach den Leitlinien von 2002 als auch von 2008 die Diagnose einer wahrscheinlichen IPA aufgrund von Wirtsfaktoren, klinischen Haupt- und Nebenmerkmalen sowie GM-Positivität.

Beachten Sie abschließend, dass weder der LFD-Assay noch der PCR-Assay derzeit in den E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien für BAL-Proben von Patienten sechs und zwölf enthalten sind; dennoch besteht eine starke Übereinstimmung zwischen beiden Assays und dem kommerziellen Galactomannan-Test, die auf das Vorhandensein von Aspergillus-Antigen und -Nukleinsäure nach diesem Verfahren hinweist. Andere Methoden wie der Platellia-Galactomannan-Enzymimmunassay, panf, der Test auf pilzliches Beta-Glucan oder Aspergillus-PCR-Tests können parallel durchgeführt werden, um eine invasive Pilzerkrankung zu bestätigen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blutserum und BAL-Flüssigkeiten äußerst gefährlich sein kann, und dass die Gerätebediener stets gegen Krankheiten wie Hepatitis B und Tuberkulose geimpft sein sollten.