Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zu demonstrieren, wie Nitric-Oxid-Metaboliten in biologischen Proben genau und spezifisch nachgewiesen werden können. Dies wird erreicht, indem Blutproben unmittelbar nach der Entnahme bearbeitet werden, um einen Verlust von Metaboliten oder die Bildung von Artefakten zu verhindern. Gleichzeitig wird eine schnelle und effiziente Gewebeentnahme durchgeführt, um die Auswirkungen einer hypoxischen Umgebung auf Nitric-Oxid-Metaboliten zu minimieren.

Aortaringe werden entnommen und in ein Organbad gehängt, um ihre endotheliale Funktion zu bewerten. Außerdem werden biochemische Assays verwendet, um die Nitratkonzentrationen, Nitritkonzentrationen sowie die relativen Konzentrationen von Nitrothiolen und anderen nitrierten Produkten im Gewebe zu quantifizieren. Mithilfe dieser Assays lässt sich ein aussagekräftiger Vergleich zwischen Versuchs- und Kontrolltieren durchführen, der wertvolle Informationen über die Produktion und den Stoffwechsel von Stickstoffmonoxid liefert.

Der Hauptvorteil der Anwendung dieses multimodalen Ansatzes im Vergleich zu einzelnen Methoden oder Assays liegt darin, dass er ein umfassenderes Bild der Stickstoffmonoxid-Biochemie in mehreren Organsystemen ermöglicht. So können wir verstehen, welche dieser Metaboliten eine prognostische oder diagnostische Relevanz besitzen und wie das Spektrum der Stickstoffmonoxid-Metaboliten die endotheliale Bildung und Verfügbarkeit von Stickstoffmonoxid widerspiegelt. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da jeder Schritt im Verfahren für die Erhaltung der Probenechtheit von großer Bedeutung ist.

Einige dieser Schritte sind aus der Lektüre des Methodenteils typischer Fachzeitschriften nicht ersichtlich, da sie sehr detaillierte Angaben zur Probenentnahme und Gewebeextraktion enthalten. Diese Prozedur wird Dr. Hong Jing demonstrieren, eine leitende Wissenschaftlerin in meinem Labor. Für diesen Protokollablauf muss eine Person oder ein Versuchstier für die Blutentnahme zur Verfügung stehen; bei Versuchstieren werden zudem deren Gewebe untersucht.

Zunächst wird Vollblut durch Einführen einer 25-Gauge-Nadel in die untere Hohlvene gewonnen. Sobald 500 bis 1000 Mikroliter gesammelt wurden, wird das Tier durch Spülung mit physiologischem Puffer über die Spitze des linken Ventrikels von verbleibendem Blut befreit, wobei eine vollständige Blutersetzung erfolgt, während Blut und Puffer über die untere Hohlvene austraten. Das venöse Blut ist unmittelbar nach der Entnahme in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit NEM und EDTA zu sammeln.

Zentrifugieren Sie das Blut bei 14.300 RCF für sieben Minuten. Entfernen Sie das Plasma mit einer Pipette vom Erythrozyten-Pellet und überführen Sie es in ein separates Gefäß. Bereiten Sie die isolierten Plasma-Proben für die HPLC vor, indem Sie zuerst 50 Mikroliter der Plasmaprobe ein gleichen Volumen kaltes Methanol hinzufügen.

Vortexen Sie die Mischung kräftig für drei bis fünf Sekunden, bis sie trüb wird. Zentrifugieren Sie die Mischung anschließend bei 14.300 RCF für sieben Minuten. Um die Plasmaproteine auszufällen, sammeln Sie den Überstand in einem separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis er analysiert werden kann.

Um das Plasma für die Chemilumineszenzanalyse vorzubereiten, nehmen Sie das verbleibende Plasma, das etwa 200 bis 400 Mikroliter betragen sollte, und teilen es in zwei Volumina auf. Bereiten Sie die eine Hälfte des Plasmas vor, indem Sie ein 10%-Volumen an 5%iger angesäuerter Sulfidlösung hinzufügen und 10 Minuten warten. Diese Probe ist nun bereit für die CLD-Analyse.

Bereiten Sie die andere Hälfte des Plasmas vor, indem Sie nach fünf Minuten 10 % des Volumens von 2 % Quecksilber(II)-chlorid hinzufügen. Geben Sie bei Raumtemperatur 10 % des Volumens an angesäuertem Sulfonamid hinzu. Warten Sie weitere 10 Minuten und injizieren Sie diese Probe wie das Plasma in das CLD.

Das Erythrozyten-Pellet kann für die HPLC und die CLD für eine der beiden Analysen vorbereitet werden. Geben Sie zunächst ein Teil Zellpellet zu vier Teilen hypotoner Lyse-Lösung. Vortexen Sie die Mischung gründlich für die CLD-Analyse.

Die Vorbereitung der Zellen erfolgt genauso wie für Plasma. Geben Sie zunächst eine gleiche Menge Methanol hinzu. Vortexen Sie dann das Gemisch kräftig für drei bis fünf Sekunden und zentrifugieren Sie es anschließend sieben Minuten bei 14.300 RCF.

Pipettieren Sie nun den Überstand ab und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis er mittels HPLC analysiert werden kann, um die Gewebegehalte an Metaboliten von Stickstoffmonoxid zu bestimmen. Bei den interessierenden Geweben von Versuchstieren sollte zunächst das Blut gemäß dem vorherigen Abschnitt geerntet und vorbereitet werden; die Gewebeentnahme sollte anschließend wie üblich erfolgen, wobei besonderes Augenmerk auf Schnelligkeit und Effizienz gelegt werden muss, damit die Gewebe nicht hypoxisch werden. Nach der Sammlung werden die Gewebeproben im Verhältnis 1:5 in PBS mit N-E-M-E-D-T-A homogenisiert.

Bereiten Sie anschließend die homogenisierten Gewebe für die HPLC- und CLD-Analyse wie in den vorherigen Abschnitten für Erythrozyten beschrieben vor. Betäuben Sie eine erwachsene Maus mit Dathyläther und überprüfen Sie, dass sie nicht auf einen Zehenquetschtest reagiert, führen Sie dann eine Thorakotomie durch. Ein medianer Einschnitt wird vom Sternum bis zur Schambeinregion vorgenommen, um die Brust- und Bauchhöhle freizulegen.

Als Nächstes perfundieren Sie das Tier mit oxygeniertem Krebs-Alite-Puffer. Injizieren Sie den Puffer mit einer 25-Gauge-Spritze in die Spitze des linken Ventrikels. Der rechte Vorhof wird dabei geöffnet, um dem Blut einen Austritt zu ermöglichen.

Nach der Perfusion die Bauchaorta isolieren, indem Leber, Lunge und andere Gewebe, die die Aorta bedecken könnten, abgeschnitten und entfernt werden. Danach das Herz mit einer Pinzette festhalten und die Aorta vorsichtig von der Hinterwand des Tieres ablösen. Herz und Aorta in eine mit Eis gefüllte Petrischale legen.

Kaltes Krebs-Puffer in der Petrischale. Vorsichtig das Fett- und Adventitiagewebe von der Aorta abschneiden und reinigen. Während der Reinigung darauf achten, das Endothel im Inneren des Gefäßes nicht zu beschädigen.

Halten Sie den Stoffwechsel der Aorta langsam, um Hypoxie zu verhindern, indem Sie sie alle fünf Minuten in frischen, eiskalten, mit Sauerstoff angereicherten Puffer überführen. Schneiden Sie die Aorta nun mit einem Skalpell in ringförmige Segmente von drei Millimeter Länge. Überführen Sie die Segmente in ein vierkanaliges 10-Milliliter-Gewebeorganbad, das mit mit Sauerstoff angereichertem Krebs-Puffer gefüllt ist.

Unter Verwendung des Transducer-Knopfs 1,5 Gramm Vorspannung auf jeden Aortenring aufbringen. Gemäß empirischen Befunden ist 1,5 Gramm die geeignete Ausgangsspannung für eine optimale vasomotorische Funktion.

Überwachen und erfassen Sie am Mauspräparat die Kraftmessung mithilfe einer achtkanaligen Octal-Brücke und einer Datenerfassungssoftware, lassen Sie die Ringe 80 Minuten lang equilibrieren, wobei Sie die Pufferlösung alle 20 Minuten wechseln, und führen Sie anschließend die Experimente durch. Nachdem die Gewebespannung equilibriert ist, geben Sie 100 Nanomolar Fennelrin zu jedem Ring, um eine submaximale Kontraktion zu erzielen. Sobald die Ringspannung stabil ist und ein gleichmäßiger Tonus vorliegt, führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Analyse mit einem endothelialen Agonisten wie Acetylcholin durch.

Dies dient der Bestimmung der Stickoxidproduktion und des Ausmaßes der Gefäßrelaxation. Nach der Dosis-Wirkungs-Kurve auf Acetylcholin spülen Sie die Badgefäße mit Krebs-Puffer und geben 100 Nanomolar Fencholin je Organbad hinzu, um die Gefäße zu kontrahieren. Bestimmen Sie anschließend erneut die Empfindlichkeit der glatten Muskelringe gegenüber einer exogenen Stickoxidquelle wie Natriumnitroprussid, jeweils mit und ohne ODQ, einem Inhibitor der löslichen Guanylatcyclase.

Diese Art der Versuchsdurchführung bestimmt einen 100 %igen Relaxationswert für die Gefäße und zeigt zudem die entscheidende Bedeutung der löslichen Guanylatcyclase bei der Vermittlung der Reaktion auf vasodilatierendes Stickoxidoxid auf. Da ODQ die Relaxation durch Natriumnitroprussid in Reaktion auf Acetylcholin verhindert, relaxierten Aortenringe von gesunden Kontrollmäusen, während Aortenringe von Mäusen mit endothelialer Dysfunktion eine verminderte Relaxation zeigten, bedingt durch eine reduzierte Produktion von Stickoxid. Gruppenspezifische Denitrosierungsassays wurden ebenfalls an Kontrolltieren mittels Chemilumineszenz von Nitrit durchgeführt.

RSNO und RNNO wurden mithilfe eines reduktiven Denitrosierungs-Assays nachgewiesen. Durch Subtraktion der Peakflächen wurden Nitrit- und rSNO-Spiegel gemessen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Stickstoffmonoxid und vaskuläre Biologie zu beantworten, beispielsweise wie die zirkulierenden Spiegel dieser Stickstoffmonoxid-Metaboliten die Gewebespiegel widerspiegeln und wie sich Metaboliten bei verschiedenen Krankheitszuständen verändern.

Die Bestimmung der Gleichgewichtskonzentrationen und der Halbwertszeiten dieser relevanten Stickstoffmonoxid-Metaboliten in mehreren Organsystemen sowie im gesamten Kreislauf eines einzelnen Tieres ermöglicht die Identifizierung spezifischer molekularer Krankheitsmarker und hilft uns, neue auf Stickstoffmonoxid basierende Behandlungsmodalitäten zu definieren, wodurch der behandelnde Arzt mit besseren Biomarkern für Schweregrad oder Progression von Erkrankungen ausgestattet werden kann. Im Allgemeinen haben Personen, die neu im Bereich der Salpetersäure sind, Schwierigkeiten, da viele Methoden nicht empfindlich genug sind, um diese geringen Konzentrationen an Salpetersäure-Metaboliten in biologischen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren. Vor allem können unsachgemäße Handhabungstechniken während der Probenvorbereitung Artefakte erzeugen, die zu fehlerhaften Daten und einer falschen Interpretation der Ergebnisse führen.