Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Einsatz der Bildstromtechnologie zur Quantifizierung zellulärer Mechanismen primärer Immunzellen aus gut definierten Patientenkohorten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst periphere mononukleäre Blutzellen oder PBMC aus Blutproben von Patienten oder gesunden Probanden isoliert werden. Nach der Isolation werden die Zellen aktiviert und anschließend fluoreszenzmarkiert.

Anschließend werden die Zellen hydrodynamisch fokussiert, mit Laserlicht angeregt und mittels einer Zeitverzögerungsintegations-CCD-Kamera aufgezeichnet. Abschließend erfolgt die Bildaufnahme mithilfe des Image-Stream-Cytometers und die Quantifizierung von NF-kappa-b.

Die Translokation in jedem zellulären Bild wird mithilfe der Ideas-Software durchgeführt. Letztendlich können die Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen durch die Analyse von Punktdiagrammen, Histogrammen und Zellbildern bestimmt werden. Der Vorteil des Image Streams liegt darin, dass er Fakten und Immunfluoreszenz kombiniert.

Wir können Zell-Signalwege auf eine linien-spezifische Weise untersuchen, entweder auf Einzelzell- oder Populationsebene, ausgehend von nur einer kleinen Blutprobe. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Wissensstand zu klären, indem sie die Lokalisierung und Quantifizierung von Signalvermittlern ermöglicht. Beispielsweise kann sie verwendet werden, um die durch Wirkstoffe vermittelte nukleäre Translokation von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen oder die Auswirkungen des Alterns auf die Zellbiologie zu analysieren.

Ein Leiter aus meinem Labor wird die Technik demonstrieren, nachdem periphere mononukleäre Blutzellen, die von menschlichen Freiwilligen gewonnen wurden, isoliert wurden. Resuspendieren Sie die gewonnenen pBMKs mit drei mal 10 hoch sechs Zellen pro 0,6 Milliliter Medium und überführen Sie dann die Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stimulieren Sie anschließend einen Teil der Zellen mit einem Aktivierungsagenten wie hier dem TLR8-Liganden R848 und inkubieren Sie alle Zellen danach 10 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator.

Nach der Inkubationszeit pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 × g und Raumtemperatur, entfernen das Überstand und markieren die Zellen mit einem Cocktail von Oberflächenantikörpern, die spezifisch für Monozyten- oder DC-Linien sind, für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, einschließlich Röhrchen mit Zellen, die mit einkettigen Farbstoffkonjugaten markiert sind und als Kompensationskontrollen verwendet werden. Danach fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA-PBS. Nach einer Zentrifugation der Zellen für 10 Minuten bei 500 × g und Raumtemperatur resuspendieren Sie die PBMCs in Einfrierpuffer und lagern die Zellen bis zur Analyse am Tag des Assays bei minus 80 Grad Celsius.

Tauen Sie die Zellen schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf und permeabilisieren Sie sie nach der Zentrifugation zur Entfernung des Einfrierpuffers mit 100 Mikroliter BD-Perm-Waschpuffer. Anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Antikörpern gegen intrazelluläre Signalkomponenten wie hier die gezeigten Anti-NF-kappaBp65-Antikörper markieren. Nach dem Aufsammeln der Zellen durch Zentrifugation diese in 100 Mikroliter BD-Perm-Waschpuffer, der Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG enthält, resuspendieren.

Alexa 6 47 und inkubieren Sie die PBMC weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. Unmittelbar vor der Bildaufnahme färben Sie die Zellen mit einem Kernfarbstoff nach. Schalten Sie zunächst den Image Stream ein und starten Sie dann die Inspire-Software. Klicken Sie danach auf „Standardvorlage laden“ und wählen Sie anschließend „Fluidik initialisieren“.

Klicken Sie dann auf das Bildergalerie-Menü und wählen Sie alle aus. Drücken Sie nun „Run Setup“, um die Aufnahme der Perlen zu starten, und wählen Sie anschließend den Hellfeldkanal aus. Sobald die Geschwindigkeitsperlen laufen, klicken Sie im Register „Assist“ auf „Start All“, um das Instrument zu kalibrieren und zu testen.

Nachdem das ImageStream-System kalibriert wurde, drücken Sie Spülen, Verriegeln und Laden, um die hellste Probe in das Gerät einzuladen. Stellen Sie dann die Laserleistung so ein, dass jeder Flora-Chrom einen maximalen Pixelwert zwischen 104.000 Zählungen aufweist, gemessen in den Punktdiagrammen. Anschließend legen Sie die Zellklassifizierungskriterien fest.

Klicken Sie nun auf „Run“, um die Datenerfassung zu starten, und speichern Sie die experimentellen Datendateien. Öffnen Sie zuerst die erfassten Datendateien in der Analysesoftware „Ideas“. Erstellen Sie dort kompensierte Bilddateien und setzen Sie danach ein Tor (Gate) auf Ereignisse mit normaler Intensität der Kernfärbung und einem hohen Aspektverhältnis der Kernfärbung. Um einzelne Zellen im R1-Tor von Zelltrümmern oder mehrzelligen Ereignissen zu unterscheiden, werden Monozyten innerhalb des Tores für CD14-positive Zellen identifiziert. Myeloide dendritische Zellen, die einen hohen Gehalt an CD11c, einen niedrigen Gehalt an CD4 sowie an Lin1-Markern aufweisen, befinden sich im R3-Tor.

Verwenden Sie abschließend die Ideas-Software, um die Kolokalisation des zytoplasmatischen Transkriptionsfaktors NF kappa B mit dem nukleären Farbstoff zu bestimmen. Eine hohe Korrelation zwischen NF kappa B und dem nukleären Farbstoff, die auf eine Kolokalisation der beiden Marker hinweist, spiegelt sich in einem hohen Ähnlichkeitswert wider und zeigt das Ausmaß der Zellaktivierung an. Der Prozentsatz der Ereignisse mit hohem Ähnlichkeitswert zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen oder Patientenpopulationen kann verglichen werden, um die relative funktionelle Effizienz der Zellen mittels Ideas zu bewerten.

Mit Hilfe von Software können anschließend Bilder von Zellen aus Schlüsselsegmenten von Populationshistogrammen dargestellt werden. ImageStream ermöglicht die Gating von Zellsubpopulationen direkt aus PBMCs und die Abbildung von Zellantworten aus gegateten, aber nicht sortierten Zellpopulationen. Hier wurde der Einfluss der TLR-Signaltransduktion auf die nukleäre Lokalisation von NF-kappa-B-p65 in Lin-1-negativen, CD4-dim, CD11c-positiven myeloischen DCs im Ausgangszustand quantifiziert.

Ein hoher Prozentsatz an unstimulierten Zellen mit dem Transkriptionsfaktor NF kappa B p65 im Zytoplasma wurde beobachtet. Nach Stimulation wiesen die behandelten Zellen einen signifikant höheren Ähnlichkeitswert von NF kappa B p65 mit der nukleären Färbung PI auf, was darauf hinweist, dass NF kappa B p65 nach Stimulation in den Zellkern translozierte. Digitale Bilder, die gleichzeitig von den unbehandelten oder mit R848 stimulierten Zellpopulationen aufgenommen wurden, zeigen repräsentative Zellen und die Intensität der Translokation von NF kappa B in den Zellkern. Beachten Sie die stärkere Intensität der NF kappa B- und PI-Färbung in der mit R848 stimulierten Gruppe im Vergleich zu den unbehandelten Zellen.

Wir haben diese Technik an Zellen von Spendern unterschiedlichen Alters angewendet und Unterschiede in den TLR-vermittelten NF-kappa-B-Aktivierungswegen gezeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb eines Tages durchgeführt werden, zuzüglich Zeit für die Bildanalyse, wodurch sowohl mehrere Lokalisierungsbilder als auch Populationsstatistiken ermöglicht werden. Außerdem können wir Reaktionen direkt aus mehreren Zellpopulationen abbilden, ohne dass eine physische Trennung erforderlich ist. Der Bildstrom kann breit auf eine Vielzahl zellulärer Mechanismen angewendet werden und sollte in der translationsmedizinischen Forschung von großem Wert sein.