TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Vio-Cray genetisch mittels dieser schnellen und defizienten Methode zu verändern, die auf natürlicher Transformation und Flip-Kombination basiert. Dies wird erreicht, indem zunächst eine geeignete Chitinquelle vorbereitet wird, da Chitin der natürliche Induktor der Transformation ist. Im zweiten Schritt wird ein DNA-Konstrukt mittels zweier PCR-Runden erzeugt, und anschließend erfolgt deren natürliche Transformation, wodurch das Plasmid PBR flip enthaltende Bakterien das PCR-Fragment aufnehmen und in ihr Genom integrieren können.

Anschließend erfolgt eine Temperaturerhöhung zur Induktion des plasmidcodierten Lipaseenzyms, um die das Antibiotikaresistenzkassette flankierende Flip-Rekombinationstelle (FRT) zu entfernen. Im letzten Schritt werden die Bakterien von dem das FLP kodierenden Plasmid befreit. Abschließend werden PCR und Sequenzierung verwendet, um nachzuweisen, dass die genetische Modifikation erfolgreich war.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Verwendung von Suizid-Plasmiden zur genetischen Manipulation von Viren, liegt darin, dass diese Methode sehr schnell und effizient ist. Wiegen Sie zunächst 50 bis 80 Milligramm Proben von Chitin-Flocken in standardmäßigen 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen ab, lassen Sie die Deckel der Röhrchen geöffnet und autoklavieren Sie die Flocken. Sobald der Autoklav fertig ist, schließen Sie die Deckel unverzüglich und lagern Sie die autoklavierten Chitin-Flocken bei Raumtemperatur. Mindestens sechs Oligonukleotide sind erforderlich, um die DNA-Bereiche von Interesse sowie die durch FRT flankierte Antibiotika-Kassette mittels PCR zu amplifizieren. Es wird außerdem empfohlen, ein Paar Oligonukleotid-Primer außerhalb des eingefügten PCR-Fragments einzubeziehen.

Dies ermöglicht die Überprüfung der Integration und der korrekten Entfernung der von FRT-Flanken umgebenen Antibiotikaresistenzkassette, der Oligonukleotide Nummer zwei, Nummer drei, Nummer vier und Nummer fünf, mit Sorgfalt. Die Primer Nummer zwei und fünf sollten mindestens 28 Basenpaare enthalten, um ausreichend an die genomische DNA und die Primer binden zu können. Die Primer drei und vier sollten unter Verwendung eines Plasmids, das eine FRT-Sequenz enthält, als Vorlage konstruiert werden; die Primer zwei und fünf sind so zu entwerfen, dass eine umfangreiche komplementäre Basenpaarung am 5′-Ende zwischen den Primern zwei und drei sowie zwischen den Primern vier und fünf jeweils ermöglicht wird.

Nun führen Sie für die erste Runde der PCR mit den Oligonukleotiden eins und zwei die erste von drei gleichzeitigen, aber unabhängigen PCR-Reaktionen durch, um den upstream gelegenen Bereich des experimentellen Interessenbereichs der kundenspezifisch konzipierten Konstrukte zu amplifizieren. Parallel dazu bereiten Sie die zweite PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide drei und vier vor, um die durch FRT flankierte Antibiotika-Kassette zu amplifizieren. Beispielsweise wurde in diesem Experiment das APH-Gen, das für Kanamycinresistenz kodiert, verwendet.

Amplifizieren Sie gleichzeitig den downstream gelegenen DNA-Abschnitt, indem Sie die dritte PCR-Reaktion mit den Oligonukleotiden fünf und sechs sowie genomischer DNA als Vorlage vorbereiten. Starten Sie anschließend die PCR-Reaktion für alle drei Proben, nachdem alle drei PCR-Fragmente gereinigt wurden. Verwenden Sie ein Gemisch mit gleichen Mengen der in der ersten Runde erhaltenen Fragmente als Vorlage, um eine zweite PCR-Runde durchzuführen. Diese Amplifikation wird durch die Oligonukleotide eins und sechs katalysiert.

Das resultierende PCR-Fragment dient als transformierende DNA in den Experimenten zur natürlichen Transformation. Nach dem Anzüchten von V. cholerae-Zellen in angereichertem Medium unter aeroben Bedingungen bei 30 Grad Celsius. Die Bakterien durch Zentrifugation bei Raumtemperatur gewinnen.

Übertragen Sie als Nächstes die Bakterienkultur in Form von Flocken auf den Drachen und inkubieren Sie die Zellsuspension über Nacht bei 30 Grad Celsius. Geben Sie anschließend mindestens 200 Nanogramm der aus der zweiten PCR-Runde stammenden Fragmente vorsichtig in die Bakteriensuspension. Achten Sie darauf, die Bakterien nicht stark von den Chitinoberflächen zu lösen, und inkubieren Sie diese Lösung dann einen weiteren Tag lang bei 30 Grad Celsius ohne Bewegung.

Nun vortexen Sie die Kultur mindestens 30 Sekunden lang kräftig und geben 100 bis 300 Mikroliter der Zelllösung auf doppelt selektive Platten, die Ampicillin sowie ein weiteres Antibiotikum enthalten. Inkubieren Sie die Bakterienkulturen bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar sind. Isolieren Sie anschließend die einzelnen Transformanten von den selektiven Platten.

Beginnen Sie diesen Schritt mit dem Anzüchten der Bakterien auf LB-Agar-Platten mit Ampicillin bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Optional kann die Temperatur für zwei bis drei Stunden auf 40 Grad Celsius erhöht werden, da die Expression von flip aus dem PBR-flip-Plasmid bei höheren Temperaturen dereprimiert wird. Nach weiteren acht Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius werden die Bakterien auf frische Platten übertragen.

Jetzt die Klone parallel auf Antibiotikahaltigen und antibiotikafreien Agarplatten einschränken, um die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika zu testen, und anschließend eine einzelne resultierende, antibiotikasensitive Kolonie isolieren. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Kultur über Nacht unter aeroben Bedingungen bei 30 Grad Celsius in einem Medium ohne Antibiotika anreichern. Am nächsten Morgen eine neue Kultur für drei bis sechs Stunden durch Verdünnen der Übernachtkultur im Verhältnis 1:100 in frischem, antibiotikafreiem Medium aufziehen. Am Nachmittag erfolgt die Strich- oder Plattendilution der Kultur auf einfachen LB-Agarplatten, gefolgt von einer Inkubation der Platten für weitere acht bis 16 Stunden bei 30 Grad Celsius, bis die Kolonien sichtbar sind.

In diesem ersten Experiment, das darauf abzielte, die benachbarten Gene CTXA und CTXB zu löschen, wurden die Oligonukleotide für die trans-Flip-Methode erzeugt, wie gerade am Elternstamm demonstriert. Der intermediäre Stamm, der die durch FRT flankierte Antibiotikaresistenzkassette anstelle des ursprünglichen DNA-Lokus von C-T-X-A-B enthält, sowie der finale Stamm, aus dem C-T-X-A-B gelöscht und die Resistenzkassette entfernt wurde, wurden alle auf ihr Genotypmuster getestet. Für dieses Experiment wurde eine komplette PCR durchgeführt, wobei Primer verwendet wurden, die nicht an das transformierende PCR-Fragment, sondern ausschließlich an die chromosomale DNA binden. Die PCR-Fragmente wurden mittels standardmäßiger Agarosegelelektrophorese getrennt, um ihre Größe zu bestimmen.

In Spur eins befand sich der Weltstamm vom Typ B Cholera bei der erwarteten Fragmentgröße von 3.143 Basenpaaren. In Spur zwei befand sich das PCR-Fragment, das vom Stamm delta C-T-X-A-B-F-R-T kann. FRT stammt, bei 3.162 Basenpaaren.

Und in Spur drei befand sich das Delta-ctxA-B-FFR-TP-CR-Fragment bei 1.769 Basenpaaren im Vergleich zur 1-KB-Leiter. Im zweiten Beispiel, bei dem eine gesamte genomische Insel entfernt wurde, wurde die Vibrio-Pathogenitätsinsel eins oder VPI eins als Ziel für dieses Experiment gewählt. Die Trans-Flip-Methode wurde in zwei Schritten modifiziert.

Zunächst erfolgte die Integration des Kanamycin-Resistenzgens durch eine einzelne FRT-Stelle am Anfang der Pathogenitätsinsel eins. Anschließend wurde eine zweite Runde der natürlichen Transformation durchgeführt, die die Einfügung eines zusätzlichen Antibiotikaresistenzmarkers ermöglichte, nämlich der Gentamicin-Resistenz, gefolgt von einer zweiten FRT-Stelle am Ende der Pathogenitätsinsel. Die jeweiligen Primerpaare sind über jedem Gelelektrophoresebild angegeben, und die trans-FLP-Methode wurde wie gerade gezeigt fortgesetzt.

Die elterlichen, intermediären und endgültigen Stämme wurden alle durch PCR der gereinigten genomischen DNA in Lane eins verifiziert. Das PCR-Fragment des Wildtyp-Stamms von V. cholerae wurde in Lane zwei laufengelassen. Das durch den Stamm VPI-1-FRT::GM-FRT erzeugte PCR-Fragment wurde laufengelassen.

Und in Spur drei wurde das aus dem Stamm delta VPI eins FRT abgeleitete PCR-Produkt analysiert. Die Primer-Paare sind über jedem Gelelektrophoresebild angegeben. Der endgültige Stamm fehlt das gesamte VPI eins.

Im dritten Beispiel wurde eine T7-RNA-Polymerase-abhängige Promotorsequenz mithilfe der Trans-Flip-Methode mit geringfügiger Abwandlung des Standardprotokolls upstream in das Gen T fox, einen wichtigen Regulator der natürlichen Transformation, integriert. Die Konsensussequenz des T7-RNA-abhängigen Promotors wurde als Überhänge in die Oligonukleotide Nummer vier und Nummer fünf eingefügt, sodass diese DNA-Sequenz im Chromosom erhalten blieb. Auch nach Entfernung des Antibiotikaresistenzkassette wurde der Konstrukt anschließend in einen T7-RNA-Polymerase-enthaltenden V-colorisierten Stamm integriert.

In diesem Stamm wurde die Expression des T7-RNA-Polymerase-Gens durch den LAC UV5-Promotor gesteuert, um die T7-RNA-Polymerase-abhängige Expression von T Fox zu testen. Natürliche Transformationsassays wurden in LB-Medium durchgeführt. Der Elternstamm, dem der T7-abhängige Promotor vor dem Gen T Fox fehlt, ist unter diesen Bedingungen aufgrund der fehlenden T-FOX-Transkription in reichem Medium und in Abwesenheit seines natürlichen Induktors Chitin nicht natürlich transformierbar. Dieses Phänotyp war unabhängig davon, ob die T7-RNA-Polymerase künstlich durch IPTG induziert wurde oder nicht.

Jedoch war der Trans-Flip-Generierungsstamm, der den von der T7-RNA-Polymerase abhängigen Promotor upstream des Kompetenzgens T Fox enthält, tatsächlich aufgrund der Leckage des LAC UV 5-Promotors im LB-Medium in der Lage, sich natürlich in Anreicherungsmedium zu transformieren. Die produzierte T7-RNA-Polymerase transkribierte bereits T Fox vom T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotor, ohne dass eine Induktion durch IPTG erfolgte. Dies initiierte die natürliche Kompetenz und Transformation und bestätigte somit die Funktionalität der integrierten, von der T7-RNA-Polymerase abhängigen Promotorsequenz.

Dieses Phänotyp wurde signifikant verstärkt durch die vollständige Induktion der T7-RNA-Polymerase, die durch die Zugabe des Induktors des lacUV5-Promotors IPTG ausgelöst wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Vibrio cholerae genetisch mittels einer Kombination aus chitininduzierter natürlicher Transformation und Flip-Rekombination verändert. Sobald diese Technik beherrscht ist, ermöglicht sie das gezielte Löschen von Genen oder genomischen Inseln sowie die Integration von DNA-Sequenzen innerhalb weniger Tage auf site-direktionierte Weise.