Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, das lösliche und unlösliche Pion-Protein oder PRP aus allen Bändern im normalen menschlichen Gehirn zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das menschliche Hirngewebe homogenisiert und die Fraktionen isoliert werden. Anschließend erfolgt die Geschwindigkeits-Sedimentation in sukzessiven Saccharose-Gradienten.

Dann wird eine Gelpermeationschromatographie durchgeführt. Schließlich wird PRP mit dem Gen-fünf-Protein oder G fünf P erfasst. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Isolierung löslicher und unlöslicher PRP oder Ligamente aus dem normalen menschlichen Gehirn durch Ultrazentrifugation in Saccharose-Stufengradienten, Größenausschlusschromatographie und Erfassung von PRP mittels G fünf P zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Forschung zu Prionerkrankungen zu beantworten, einschließlich der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, der BO-Ponton-Enzephalopathie und klinischer Abbauekrankungen. Zudem können sie Einblicke in die Isolierung löslicher und unlöslicher Proteinaggregate liefern, nicht nur bei Prionerkrankungen, sondern auch bei anderen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in diesen Methoden sind, Schwierigkeiten haben, da alle experimentellen Schritte wichtig sind und besondere Sorgfalt erfordern. Eine Video-Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die SEC-Fi-Tiefe groß ist und die PRP-Gewinnung mit G-five-P schwierig zu benennen ist; diese Schritte können ohne präzisere Durchführung problematisch sein. Um ein Gehirnhomogenat herzustellen, geben Sie zunächst 100 µL Puffer zur Zelllyse zu 100 mg gefrorenem Hirngewebe unter Verwendung eines motorisierten Stößels, homogenisieren das Gewebe auf Eis, gefrieren es fünf Minuten lang auf Trockeneis ein und homogenisieren es erneut.

Stellen Sie ein 20 % oder 10 %iges Gesamthirnhomogenat her, indem Sie jeweils 300 oder 800 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Homogenat in einer Tischzentrifuge bei 1000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie die SNA und zentrifugieren Sie die S1-Fraktion in einem SW 55-Rotor bei 35.000 U/min für eine Stunde bei vier Grad Celsius.

Überführen Sie das Überstand in ein sauberes Röhrchen (Resus). Suspendieren Sie das detergentenunlösliche Pellet in Puffer zur Lyse, um Proben für die Westernblot-Analyse vorzubereiten. Inkubieren Sie die Fraktionen S zwei und P zwei mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von fünf Millimolar PMSF und SDS-Probenpuffer. Kochen Sie die Proben 10 Minuten lang und lassen Sie sie anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur abkühlen. Um die Geschwindigkeitszentrifugation durchzuführen, inkubieren Sie zunächst 450 Mikroliter der 20 % S1-Fraktion mit einem gleichen Volumen 2 % Sarco X in Wasser 30 Minuten lang auf Eis in 5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie jeweils 0,5 Milliliter der 60, 30, 25, 20, 15 und 10 %igen Saccharose-Lösungen hinzu und überlagern Sie 0,4 Milliliter der inkubierten S1-Probe auf die 10–60 %ige Saccharose.

Zentrifugieren Sie mit einer Stufengradientenzentrifugation im SW 55-Rotor bei 48.000 U/min eine Stunde lang bei vier Grad Celsius ausgehend von der Oberseite des Röhrchens. Sammeln Sie 12 gleiche Fraktionen zu je 283 Mikrolitern. Verwenden Sie 20 Mikroliter aus jeder Fraktion und ein gleiches Volumen an SDS-Probelösungspuffer.

Um SDS-Page-Gelproben vorzubereiten, die Proben 10 Minuten lang kochen, dann vier Minuten ruhen lassen. Die Proben eine Minute bei 1000 G zentrifugieren.

Vortexen Sie sie anschließend, bevor Sie sie auf ein vorgefertigtes Gel für die Größenausschlusschromatographie auftragen. Mithilfe der Chromatographie wird der oligomere Zustand von PRP-Molekülen bestimmt. Tragen Sie zunächst 200 Mikroliter Proben von sieben einzelnen Molekülmasse-Markern auf eine 1 × 30-Säule mit SUEx-200-HR-Kügelchen auf.

Verwenden Sie das Elutionsvolumen von Blau-Dextran als Porenvolumen. Berechnen Sie die Elutionsvolumina der Peaks von VE aus dem Chromatogramm und den Fraktionsretentionen. Berechnen Sie den Partitionskoeffizienten KAV mit der Gleichung KAV gleich V minus V null geteilt durch VT minus V null.

Um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, tragen Sie den KAV der Proteinstandards gegen den Logarithmus des Molekulargewichts der Standards auf. Anschließend geben Sie 200 Mikroliter von S eins auf die Säule bei einer Flussrate von 0,25 Millilitern pro Minute.

Waschen Sie die Säule mit Lysepuffer 1 % cile und eluieren Sie mithilfe eines Fraktionssammlers 0,25-Milliliter-Fraktionen. Inkubieren Sie jeweils 125 Mikroliter aus jeder Fraktion mit 500 Mikrolitern vorgekühltem Methanol bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

Resuspendieren Sie das Pellet in 20 µL SDS-Pufffer und erhitzen Sie es 10 Minuten lang zum Sieden. Bringen Sie es auf Raumtemperatur und trennen Sie es auf 15 %igen Polyacrylamidgelen auf. Verwenden Sie die Standardkurve, um die Molekulargewichte der verschiedenen gewonnenen PRP-Spezies abzuleiten, um das G5P-Molekül an die magnetischen Perlen zu konjugieren.

Incubieren Sie 100 Mikrogramm G fünf P mit 350 Mikrolitern Toci-aktivierten magnetischen Perlen in einem Milliliter PBS bei 37 Grad Celsius für 20 Stunden. Verwenden Sie einen externen Magneten, um die G-fünf-P-Perlen an die Seitenwand der Eppendorf-Röhrchen anzulagern, und entfernen Sie die Lösung. Waschen Sie die Perlen dreimal mit je einem Milliliter PBS mit 0,1 % BSA, um unspezifische Bindungen zu blockieren.

Inkubieren Sie die mit G fünf P konjugierten Kügelchen in einem Milliliter 0,2 mol Tris, HCl, pH 7,4, das 0,1 % BSA enthält, für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal. Entfernen Sie die letzte Waschung und geben Sie ein Milliliter PBS zu, um PRP zu isolieren. Inkubieren Sie 100 Mikroliter von S eins oder P zwei mit 60 Mikrolitern G-fünf-B-konjugierten Kügelchen in einem Milliliter Bindungspuffer unter konstanter Rotation für drei Stunden bei Raumtemperatur.

Stellen Sie das Röhrchen auf den Magneten. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Waschpuffer. Entfernen Sie den letzten Waschschritt und geben Sie SDS-Probelösungspuffer hinzu.

Erhitzen Sie die Kügelchen auf 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Laden Sie die Proben auf vorgefertigte 15%-Gele auf und laufen Sie bei 150 Volt für etwa 80, 80 Minuten. Übertragen Sie die Proteine nach dem Blockieren der Membranen in 5% Milch in TBST zwei Stunden lang bei 70 Volt auf PVDF.

Incubieren Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur mit den PRP-Antikörpern. Drei F vier eins E vier anti N oder anti C, anschließend Inkubation mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern; inkubieren Sie die Membran und die Chemilumineszenzlösung gemäß den Herstelleranweisungen und belichten Sie den Film wie hier gezeigt im Vergleich zu sporadischen CRUT-Ventil-Jaakko-Krankheit- oder CJD-Proben. Eine geringe Menge unlöslichen zellulären PRP wurde in der P zwei-Fraktion aus normalen Gehirnen nachgewiesen.

Doch der größte Teil wurde im S2-Fraktion erholt. Insolubles PRP macht ungefähr fünf bis 25 % des gesamten PRP aus, einschließlich vollständiger und an den Enden abgekürzter Spezies. Analysen mittels sukzessiver Saccharose-Gradientenzentrifugation zeigten, dass zwar der größte Teil des PRPC aus nicht-CJD-Gehirnen in den oberen Fraktionen nachgewiesen wurde, jedoch wurden auch kleine Mengen von PRP in den unteren Fraktionen (9–11) detektiert, die normalerweise große Aggregate enthalten. Eine Vielzahl pathogener PRP- oder PRP-SC-Spezies, reichend von Monomeren,

Kleinere Ligamente und größere Aggregate wurden mittels Gelfiltration im Gehirn mit CRUT-Ventil-Yakup-Krankheit isoliert. Überraschenderweise wurde ebenfalls eine geringe Menge größerer Aggregate mit einem molekularen Gewicht von mehr als 2000 Kilodalton in unlöslichen Fraktionen normaler Gehirne nachgewiesen. Darüber hinaus wurden Dimere und Tetramere von PRPC nicht nur in unlöslichen Fraktionen, sondern auch in unlöslichen Fraktionen detektiert.

Nach der Behandlung mit PK und P-NGAs. Das durch G-five-P erfasste PRP wurde mit dem one-E-four-Antikörper gegen PRP 97 1 0 5 3 nachgewiesen. PK-resistente Kernfragmente, bezeichnet als PRP*-20, PRP*-19 und PRP*-7, wurden bei 20 Kilodalton, 19 Kilodalton bzw. 7 Kilodalton wanderverhalten.

Doch wurde kein PRP nachgewiesen, wenn der one-E-four-Antikörper zuvor mit einem synthetischen Peptid inkubiert wurde, das eine identische Sequenz wie das one-E-four-Epitop aufweist, was darauf hinweist, dass die von one E four detektierten Banden PRP-Fragmente sind. Der Anti-C-Antikörper detektierte zwei verschiedene PRP-Fragmente, die bei etwa 18 Kilodalton und bei etwa 12 bis 13 Kilodalton wandern. Zusätzlich zur PRP-ETE-20-Einmal-Methode.

Diese Technik kann innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das lösliche und unlösliche PRP-Polygam in der unteren menschlichen Gehirnregion nach der Entwicklung isoliert. Diese Technik ebnete den Weg für die Erforschung des Schicksals vor der Untersuchung von PIP-Bestätigungsdaten im Gehirn.