Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, zu demonstrieren, wie ein primäres neuronales Zellkultursystem zur Untersuchung der Latenz und Reaktivierung des Herpes-simplex-Virus verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst Neuronen aus den oberen Halsganglien von RA-Embryonen isoliert und anschließend Neuronen aus dissoziierten Ganglien kultiviert werden, nachdem nicht-neuronale Zellen entfernt wurden. Eine latente HSV-Infektion wird unter Verwendung eines EGFP-Virus etabliert, um die Neuronen in Gegenwart eines Inhibitors der lytischen Replikation zu infizieren.

Der nächste Schritt besteht darin, die Reaktivierung der latent infizierten Kulturen auszulösen. Schließlich wird die Effizienz der Reaktivierung durch die zeitliche Überwachung der EGFP-Expression bewertet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie unterschiedliche neuronale Signalwege die Latenz und Reaktivierung des Herpes-simplex-Virus über die Verwendung chemischer Inhibitoren, der RNA-Interferenz und der Genübertragung regulieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie detaillierte Untersuchungen der Wechselwirkungen ermöglicht, die die Latenz des Herpes-simplex-Waldes im Wirtneuron auf molekularer Ebene regulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Herpes-simplex-Wald-Latenz zu beantworten, beispielsweise welche Signale die latente Genome stilllegen und wie die Reaktivierung auf molekularer Ebene ausgelöst wird. In Neuronen kann diese Methode Einblicke in die Latenz von HSV-1 gewähren.

Es kann auch auf andere neurotrope Alphaherpesviren angewendet werden. Den Vorgang demonstrieren Marigo, Kochi und Julian Kim, beide Doktoranden in unseren Laboren. Für dieses Protokoll werden obere zervikale Ganglien oder SCG-Neuronen aus E 21-Rattenwürfen isoliert, die aus dem Uterus einer trächtigen weiblichen Ratte entfernt wurden. Arbeiten Sie in einer Präparationshaube und töten Sie jedes Wurfstück, indem Sie die Schere an der Halsbasis direkt oberhalb der Schultern ansetzen und den Kopf vom Rumpf abtrennen. Um die Ganglien freizulegen, verwenden Sie 23-Gauge-Nadeln, um den Kopf mit der Halsseite nach oben an drei Stellen festzustecken.

Befestigen Sie zuerst das Rückenmark. Ziehen Sie danach die vordere Haut über die Nase und fixieren Sie sie, und befestigen Sie drittens die Speiseröhre und Luftröhre, indem Sie sie von der Halsrückseite wegzurren. Suchen Sie das SCG, indem Sie die Bifurkation der Arteria carotis lokalisieren.

Die Arteria carotis ist eine paarige Struktur. Es gibt zwei Bifurkationen auf jeder Seite des Halses und somit zwei s CGS pro Pop. Das SCG befindet sich direkt unterhalb des Zweigs.

Trennen Sie das SCG von den Arterien, indem Sie die Aufzweigung an beiden Enden auseinanderziehen. Das SCG ist durchscheinend und farblos im Vergleich zu dem opaken, gelblichen Fettgewebe, das die Aufzweigung umgibt. Geben Sie die Ganglien in 12 Milliliter L 15.

Medium, das mit Glukose ergänzt wurde, in einem 15-Milliliter-Kegelröhrchen auf Eis. Nachdem alle sSCGs aus den Embryonen gewonnen und vorsichtig zentrifugiert wurden, zentrifugieren Sie die Ganglien eine Minute lang. Bei 600 U/min das überschüssige Medium entfernen.

Suspendieren Sie die Ganglien in einem Milliliter L-15-Medium, das Trypsin und Kollagenase enthält. Inkubieren Sie 24 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Rühren Sie alle acht Minuten. Geben Sie danach 10 Milliliter Meermedium zu, um die Trypsin-Zentrifugation für eine Minute zu inaktivieren. Entfernen Sie bei 600 U/min so viel wie möglich vom Tryin-Kollagenase-Medium und waschen Sie die Ganglien mit 10 Millilitern C-Medium, zentrifugieren Sie dabei eine Minute bei 600 U/min.

Wiederholen Sie diese Waschung einmal. Entfernen Sie das Waschmedium und resuspendieren Sie die Ganglien in einem Milliliter C-Medium, um mithilfe einer 21-Gauge-Nadel, die an einer fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, maximal 15 Auf-und-ab-Zyklen lang zu triturieren. Schließen Sie die Trituration mit einer 23-Gauge-Nadel ab, bis der Großteil der Klumpen aufgelöst ist.

Entfernen Sie verbleibende Zellklumpen, indem Sie die dissoziierten Neuronen durch einen 70-Mikron-Nylonfilter in einen 50-Milliliter-Konischkolben filtrieren. Entnehmen Sie einen 10-Mikroliter-Aliquot der gefilterten Zellsuspension und geben Sie Trypanblau hinzu, um die Anzahl der lebenden Zellen zu bestimmen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Farbstoff aktiv ausschließen, mit einem Hämozytometer.

Als Nächstes 5.000 bis 6.000 lebende Gesamtzellen in 100 Mikroliter C-Medium pro Vertiefung in eine 96-Loch-Zellkulturplatte geben, die zuvor mit Kollagen und Laminin beschichtet wurde; das C-Medium enthält 50 Nanogramm pro Milliliter Nervenwachstumsfaktor. Eine Nacht bei 37 °C inkubieren. Am folgenden Tag, Tag eins in vitro (DIV eins), auf eine korrekte Anheftung der Neurone und das Wachstum einiger axonaler Fortsätze prüfen.

Ersetzen Sie das C-Medium in den Vertiefungen durch 50 Mikroliter Neuro-Basal-Medium oder NBM, das NGF Acho und fünf Fluoro zwei Doxy Uracil enthält. Ersetzen Sie das Medium jeweils zeilenweise, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius für fünf Tage.

Überwachen Sie die Kultur täglich, um den Tod der nicht-neuronalen Zellen und das Wachstum der Neuronen zu bestätigen. Um diesen Teil des Verfahrens am sechsten Tag in vitro zu beginnen, überprüfen Sie, ob der Großteil der nicht-neuronalen Stützzellen eliminiert wurde. Es ist äußerst wichtig, unnötige mechanische Manipulationen der Neuronen zu allen Zeitpunkten auf ein Minimum zu beschränken.

Das Entfernen und Ersetzen des Mediums muss sehr schonend und langsam erfolgen, da die resultierende mechanische Belastung die Lebensfähigkeit der Neuronen beeinträchtigen kann. Geben Sie Aciclovir oder einen CV zum vorhandenen Medium in jedem Well, um eine Endkonzentration von 100 µM zu erreichen. Fügen Sie einen CV langsam und vorsichtig hinzu, um sicherzustellen, dass mechanische Kräfte die Zellen am folgenden Tag nicht negativ beeinflussen.

Zum DIV sieben infizieren Sie die SCG-Kulturen mit einem rekombinanten HSV Typ eins, der einen EGF-Reporter exprimiert, der mit dem viralen lytischen Protein US 11 fusioniert ist, bei einer Multiplizität der Infektion zwischen eins und zwei. Geben Sie das verdünnte Virus direkt in das vorhandene Medium in der Vertiefung. Führen Sie eine mock-infizierte Kontrolle sowie eine lytische Infektion durch.

Positivkontrolle in Medium ohne CV. Die Infektion zwei bis drei Stunden bei 37 Grad Celsius fortschreiten lassen. Danach das Infektionsmedium durch frisches NBM mit NGF und einem CV ersetzen. Beim Wechseln des Infektionsmediums ist äußerste Vorsicht geboten. Die Platte zu sich neigen und das Medium langsam vom Boden des Wells abnehmen.

Dann richten Sie die Pipettenspitze auf die Wandung des Wells und nicht auf den Boden des Wells, und lassen Sie das Medium sanft auf die Zellen gleiten. Ersetzen Sie jeweils eine Reihe des Mediums, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen. Bringen Sie die Kulturen zurück in den Inkubator und behandeln Sie sie dabei so schonend wie möglich, um ihre Fähigkeit, die Latenz von HSV-1 zu unterstützen, nicht zu beeinträchtigen.

Züchten Sie die Kulturen sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius, wobei das Virus in dieser Zeit die Latenzphase etabliert. Überwachen Sie während dieses Zeitraums die us11-EGFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie als Indikator für die lytische Replikation.

Wie erwartet sollte in der Kontrolle mit Scheininfektion keine GFP-Expression vorliegen. S 11 EGFP sollte nur bei der Infektion nachgewiesen werden. Positivkontrollbrüden ohne CV-Behandlung zeigen eine erfolgreiche Primärinfektion und produktive lytische Replikation an.

Um die Reaktivierung am 14. Tag im Kulturmedium (DIV 14) zu beurteilen, ersetzen Sie das enthaltene Kulturmedium vorsichtig durch frisches, CV-freies Medium, wie zuvor beschrieben. Richten Sie die Pipettenspitze dabei an die Wand der Vertiefung statt auf deren Boden und lassen Sie das Medium gegebenenfalls sanft auf die Zellen gleiten. Fügen Sie pharmakologische oder biologische Variablen wie LY 294002 in einer Konzentration von 20 Mikromolar hinzu.

Es sollte keine GFP-Expression in den mit A-CV behandelten latent infizierten Kulturen nachgewiesen werden. Bringen Sie die Zellen für einen Zeitraum von fünf bis sechs Tagen zurück auf 37 Grad Celsius. Überwachen Sie die lebenden Kulturen mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops, um Neuronen zu detektieren, die eine Reaktivierung durchlaufen.

Die Reaktivierungshäufigkeit wird berechnet, indem die Anzahl der Wells mit EGFP-positiven Neuronen gezählt und als Anteil der Gesamtanzahl der Proben-Wells ausgedrückt wird. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel, bei dem Triggerstatin, ein bekannter Induktor der Reaktivierung, auf spät infizierte SCG-Kulturen angewendet wird. Die Reaktivierung wurde täglich nach der Behandlung mit dem Wirkstoff über einen Zeitraum von fünf Tagen mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht und bewertet.

Mit TSA erreicht die Reaktivierung innerhalb von zwei Tagen 50 % des Maximums; innerhalb von fünf Tagen erreicht die Reaktivierung 60 % der Grundlinie oder der spontanen Reaktivierung, dargestellt durch DMSO. Die behandelten Kontrollkulturen liegen in diesem Experiment bei etwa 10 % und schwanken typischerweise zwischen fünf und 20 % in diesem In-vitro-System. Spät infizierte SCG-Kulturen wurden außerdem mit LY 2 9 0 0 4 behandelt.

Eine bekannte Induktionsmethode zur Reaktivierungskultur mit durch LY induzierter Reaktivierung wurde mit Kulturen verglichen, die mit dem viralen DNA-Syntheseinhibitor Phosphonoacetat (PAA) sowie mit den beiden Verbindungen gemeinsam behandelt wurden, wie hier dargestellt. Die Expression von US11-EGFP wird durch PAA in Kulturen beeinträchtigt, die zur Reaktivierung mit LY294002 induziert wurden, was darauf hinweist, dass die Expression von US11-EGFP von der viralen DNA-Replikation abhängig ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig auf die sterile Technik zu achten und die CG-Kultur so schonend wie möglich zu behandeln, um eine erhöhte spontane Reaktivierung durch Stress oder mechanische Bewegungen zu vermeiden. Nach Durchführung dieses Verfahrens zur Herstellung latenter HSV-1-Infektionen in kultivierten Neuronen können weitere Methoden wie shRNA-Knockdown und die ektopische Expression von Wildtyp- und Mutantengenen durchgeführt werden, um neuronale Funktionen zu charakterisieren, die die Latenz und Reaktivierung von HSV-1 regulieren.

Vergessen Sie nicht, dass HSV Typ 1 ein humanes Pathogen ist, das Sicherheitsvorkehrungen der Schutzstufe 2 erfordert. Sie sollten mit der Arbeit unter Schutzstufe-2-Bedingungen vertraut sein, bevor Sie dieses Verfahren durchführen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man SCG-Kulturen etabliert, um latente HSV-1-Infektionen anzulegen, und wie man eine effektive Reaktivierung in den Neuronen induziert.