Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen
5. März 2012
AVEXIS ist ein Hochdurchsatz-Protein-Interaktion Assay entwickelt, um systematisch Bildschirm für neue extrazelluläre Rezeptor-Ligand-Paare in der Zellerkennung Prozessen beteiligt sind. Es ist speziell entwickelt, um transienten Protein-Interaktionen, die schwer zu identifizieren, die mit anderen hohen Durchsatz Ansätze sind zu erkennen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuartige extrazelluläre Proteinwechselwirkungen aufzudecken, die an zellulären Erkennungsprozessen beteiligt sind, insbesondere solche, die in Membran eingebettete Rezeptorproteine umfassen. Der AveXis-Ansatz wurde entwickelt, um die sehr schwachen Bindungsaffinitäten zu umgehen, die für diese Klasse von Proteinwechselwirkungen typisch sind, sowie die Tatsache, dass Membranproteine biochemisch schwer handhabbar sind. Dies wird erreicht, indem zunächst eine rekombinante Proteinbibliothek der extrazellulären Bereiche von Zelloberflächenrezeptoren erstellt wird.
Dies wird erreicht, indem Expressionsplasmide so konstruiert werden, dass sie die ekto-domänischen Bereiche der Rezeptoren als lösliche Fragmente sowohl als monomere, biotinylierte Lockstoffe als auch als pentamere, enzymmarkierte Pröpfe erzeugen. Der zweite Schritt besteht darin, die Proteine zu exprimieren und zu normalisieren, um sie für die Interaktionsscreening bereitzustellen. Alle Proteine werden in Säugetierzellen hergestellt, um sicherzustellen, dass posttranslationale Modifikationen wie Disulfidbrücken und Glykosylierung hinzugefügt werden.
Ein entscheidender Schritt im Protokoll besteht darin, sicherzustellen, dass die Bait- und Prey-Proteine innerhalb der Bibliothek alle auf Schwellenwerte normalisiert sind. Danach folgt der spannende Teil: die Suche nach neuen Wechselwirkungen. Die Bates werden in einzelne Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgeteilt und anschließend mittels des Praises auf Wechselwirkungen untersucht.
Danach wird ein Waschschritt durchgeführt. Der letzte Schritt besteht darin, das Substrat für das Enzym hinzuzufügen, um festgehaltene Proteine auf den Arrays der Köderproteine nachzuweisen. Letztendlich kann die Auswertung eines VEX-Screens zeigen, welche Rezeptoren auf der Zelloberfläche in der Lage sind, Bindungspartner zu bilden, und daher möglicherweise an Erkennungs- und Kommunikationsprozessen zwischen Zellen beteiligt sind.
Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu gängigen Methoden der Proteingewinnung, wie dem Hefe-Zwei-Hybrid-System oder biochemischen Reinigungsverfahren, liegt darin, dass sie speziell zur Detektion von extrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen konzipiert ist. Sie eignet sich besonders gut zum Auffinden neuer Interaktionen zwischen membrangebundenen Rezeptorproteinen. Solche Interaktionen sind mit anderen Methoden schwer nachweisbar, da Membranproteine biochemisch schwer handhabbar sind und ihre typischen Gegenrezeptor-Interaktionen äußerst schwach sind.
Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Art und Weise zu beantworten, wie Zellen sich gegenseitig erkennen und miteinander kommunizieren. Auf molekularer Ebene kann sie verwendet werden, um Fragen zu grundlegenden biologischen Prozessen zu klären, beispielsweise welche Rezeptorproteine auf der Oberfläche von Ei- und Spermienzellen miteinander interagieren, oder welche Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und deren Liganden für zelluläre Vorgänge wie die Myozytenfusion oder die Bildung des Neuralleistes verantwortlich sind. Die Hauptschwierigkeit bei diesem Ansatz besteht darin, die Bait- und Prey-Proteinbibliotheken zusammenzustellen, in denen nach Interaktionen gesucht werden soll.
Es ist außerdem sehr wichtig sicherzustellen, dass die Bait- und Prey-Proteine innerhalb der für den Assay erforderlichen Schwellenwerte normalisiert sind. Dies verringert die Rate an falsch-negativen und falsch-positiven Ergebnissen. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals während meiner Doktorarbeit, als ich versuchte, einen Bindungspartner für das CD 200 Zelloberflächenprotein zu identifizieren.
Im Wesentlichen stellte ich die Frage, welches die Bindungsmuster für diesen bestimmten Rezeptor in der Zelloberfläche sind. Auch heute noch? Dies blieb zu jener Zeit eine technisch schwierige Frage, doch inzwischen war das humane Genom nahezu vollständig sequenziert, und mir wurde bewusst, dass wir nun, da wir eine vollständige Liste aller Rezeptoren in der Zelloberfläche aus dem Genom besaßen, stattdessen innerhalb dieses Satzes von Rezeptorproteinen fragen konnten, welche davon technisch miteinander interagieren können.
Das ist eine wesentlich einfachere Frage zu beantworten, und AveXis war die Methode, die wir entwickelt haben, um sie zu beantworten. Sobald eine Bibliothek von Bait- und Prä-Expressionsvektoren etabliert wurde, bereiten Sie deren Transfektion in HEC 2 9 3 E-Zellen vor, indem Sie die Zellen am Tag vor der Transfektion mit einer Dichte von 250.000 Zellen pro Milliliter in 50 Milliliter Freestyle-2 9 3-Medien ansäen, um eine effiziente Biotinylierung sicherzustellen. Ergänzen Sie das zur Herstellung von Bait-Proteinen verwendete Medium – nicht das für Prey-Proteine – mit D-Biotin. Nachdem alle Platten vorbereitet sind, inkubieren Sie die Zellen über Nacht unter Standardbedingungen.
Da Biotin eine geringe Löslichkeit und genaue Lösung hat, ziehen wir es vor, das zusätzliche Biotin abzuwiegen und es dann dem Medium zuzusetzen und am folgenden Tag kräftig zu schütteln. Transfizieren Sie 50 Milliliter kultivierter Zellen mit 25 Mikrogramm des Bait- oder Prey-Plasmids unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsreagens, um biotinylierte Baits herzustellen; cotransfizieren Sie den Bait-Konstrukt im Verhältnis 10 zu 1 mit Plasmiden, die eine sekretierte Form des ELI-Proteins Biotin-Ligase kodieren, pro Ernte.
Die Kulturen fünf Tage nach der Transfektion, indem die Zellen zunächst durch Zentrifugation bei 3000 × g für 20 Minuten pelletiert und anschließend das S-Überstand durch einen 0,22-Mikron-Filter filtriert wird. Eines der Schlüsselmerkmale von AveXis liegt darin, dass rekombinante Proteine, da sie sezerniert werden, innerhalb von Schwellenaktivitäten verdünnt oder konzentriert werden können. Wir fanden heraus, dass rekombinante Proteine eine variable Expression bis zu vier Größenordnungen aufweisen, sodass der Normalisierungsschritt das Auftreten von Falsch-positiven Ergebnissen während der Screening-Schritte verringert.
Um mit der Normalisierung des Köders zu beginnen, muss ungekoppelter Biotin aus dem Medium durch Dialyse entfernt werden, da er mit dem biotinylierten Köderprotein um die Bindungsstellen an Streptavidin konkurrieren würde. Beginnen Sie damit, den Köder in einem Dialyseschlauch zu sichern. Um eine effektive Dialyse der rekombinanten Proteine zu gewährleisten, haben wir festgestellt, dass es wichtig ist, der Dialyseschläuche eine überschüssige Oberfläche zur Verfügung zu stellen. Typischerweise verwenden wir zwei- bis dreimal mehr Schläuche, als für das zu dialysierende Volumen tatsächlich erforderlich ist.
Über einen Zeitraum von 24 Stunden wurde der Köder nach der Dialyse umfassend gegen ein geeignetes Puffermedium wie PBS dialysiert. Ein ELIZA beginnt damit, die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte mit PBST, das BSA enthält, 15 Minuten lang zu blockieren. Gleichzeitig werden auf einer sauberen Platte in PBST mit 2 % BSA serielle Verdünnungen des Köderproteins im Verhältnis 1:3 hergestellt, wobei vier Verdünnungsschritte durchgeführt werden.
Nach der 15-minütigen Inkubation die Verdünnung auf die Strep-TTR-kodierende Platte überführen und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Vertiefungen waschen und jeder Vertiefung jeweils 100 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter OX 68 hinzufügen. Die Platte weitere eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der zweiten Inkubation eine weitere Waschserie durchführen und die Platte mit Anti-US-Alkalische Phosphatase beladen.
Die Platte für eine dritte Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Danach die Platte dreimal mit PBST waschen und abschließend einmal mit PBS spülen. Um restliches Detergens zu entfernen, nach einer Stunde 100 µL Substrat 1 0 4 in Diethanolamin-Puffer mit einer Konzentration von 1 mg/mL hinzufügen.
Messen Sie bei Raumtemperatur die Absorption bei 405 Nanometern. Eine Verdünnungsreihe aus vier verschiedenen dialysierten Köder-Überständen wurde mittels ELISA unter Verwendung eines anti-CD4-Tag-Monoklonalen Antikörpers nachgewiesen. Falls die unverdünnt exprimierten Köderproteine nicht ausreichen, um alle Biotin-Bindungsstellen einer Strep-Avidin-beschichteten Platte zu saturieren, konzentrieren Sie das Protein unter Verwendung eines Viva-Spin-Konzentrators. Andernfalls verwenden Sie das Köderprotein in verdünnter Konzentration in PBST mit 2 % BSA.
Das ist gerade ausreichend, um die Biotin-Bindungsstelle des Assays zu saturieren. Quantifizieren Sie die relativen Expressionsniveaus der Präproteine mithilfe der Beta-Lactamase-Enzymaktivität. Beginnen Sie damit, eine Verdünnungsreihe des Überstandes, der die Paraproteine im PBST-Puffer mit 2 % BSA enthält, herzustellen.
Fügen Sie dann 20 µL der Verdünnung zu 60 µL einer nitrosen Stepin-Lösung hinzu, die in einer Platte geladen ist. Überführen Sie die Platte unverzüglich in ein Plattenlesegerät und messen Sie die Absorption bei 485 nm einmal pro Minute über die nächsten 20 Minuten, unter Verwendung von Zentrifugal-Konzentratoren oder Verdünnung mit PBST mit 2 % BSA. Stellen Sie die endgültige Konzentration der Proben so ein, dass alle Nitrose im Assay innerhalb von etwa sieben Minuten hydrolysiert werden, was etwa zwei Nitrose-Umsätzen pro Minute entspricht.
Beginnen Sie den AveXis-Screen, indem Sie eine streptavidin TAVR ENC beschichtete Platte in PBST waschen und die Platte durch Vorsichtiges Antippen an ein Papiertuch trocken tupfen. Fügen Sie anschließend PBST mit BSA zu jedem Well hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang. Dadurch werden unspezifische Proteinbindungsstellen blockiert.
Entfernen Sie in jedem Fall die Blockierungslösung durch gezieltes Abklopfen der Platte über einem Ausguss und geben Sie 100 Mikroliter normalisierten biotinylierten monomeren Köder in die entsprechenden Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie die Köderproben durch erneutes Abklopfen und waschen sie dreimal mit PBST ab.
Danach nach der dritten Wäsche antrocknen lassen. Nun 100 Mikroliter der normalisierten Pentamer-Präy-Konstrukt-Lösung zu jedem Well hinzufügen und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach einer Stunde die Platte dreimal zusätzlich mit PBST waschen und abschließend einmal mit PBS allein.
Als letztes 60 Mikroliter Nitrous-seven-Lösung zu jedem Well hinzufügen und die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, oder vorzugsweise 16 Stunden bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag haben positive Wechselwirkungen eine rote Färbung angenommen. Machen Sie ein Foto der Platte als visuelle Dokumentation und quantifizieren Sie anschließend die Reaktionen bei einer Absorption von 485 Nanometern mithilfe eines Plattenlesegeräts.
Ungefähr 10 Minuten nach Beginn der AveXis-Screening-Reaktion wurden gelbe bis rote Farbänderungen sowohl in der antikörpervermittelten Prÿ-Einfangkontrolle als auch in der positiven Kontrollinteraktion beobachtet. Diese Farbänderung weist auf die Hydrolyse des Stickstoffdioxids im Substrat hin. Einige positive Interaktionen sind innerhalb dieses Zeitrahmens erkennbar, die meisten erscheinen jedoch erst nach einigen Stunden.
Typischerweise wurde eine Trefferrate von etwa 0,4 bis 0,6 % positiven Ergebnissen beobachtet. Sobald die Proteinbibliotheken vorbereitet sind, kann der Screening-Teil dieser Methode schnell durchgeführt werden. Es ist durchaus möglich, bis zu 12 Platten an einem Tag zu screenen, nachdem eine Interaktion identifiziert wurde.
Der wichtigste nächste Schritt besteht erstens darin, zu zeigen, dass die Interaktion mit frischen, unabhängigen Proteinpräparationen wiederholt werden kann. Zweitens überprüfen wir stets, ob die Interaktion unabhängig von der Bait-Prey-Orientierung ist, das heißt, ob sie umkehrbar ist. Dazu gehört, die Bait-Vektordomänen in den Prey-Vektor und umgekehrt zu klonen.
Interaktionen, die wiederholt und wechselseitig erfolgen können, gelten als hochgradig verlässlich und wurden stets als positiv nachgewiesen. Unter Verwendung anderer Techniken wie der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz nutzen wir die Oberflächen-Plasmonen-Resonanz, um zusätzlich alle erneut identifizierten Interaktionen zu validieren. Wichtig ist, dass dies demonstriert, dass die beiden gereinigten Komponenten direkt miteinander interagieren können, und dass die Bindung gesättigt und somit spezifisch ist.
Übersicht
AVEXIS ist ein Hochdurchsatz-Proteininteraktionsassay, der dafür konzipiert ist, systematisch neue paare von extrazellulären Rezeptoren und Liganden zu identifizieren, die an zellulären Erkennungsprozessen beteiligt sind. Diese Methode ermöglicht den effektiven Nachweis vorübergehender Proteinwechselwirkungen, die typischerweise schwer mit anderen Hochdurchsatz-Techniken zu detektieren sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Proteinwechselwirkungen
Hintergrund
- Membrangebundene Rezeptorproteine sind entscheidend für die zelluläre Erkennung.
- Schwache Wechselwirkungsaffinitäten erschweren den Nachweis dieser Interaktionen.
- Herkömmliche Methoden wie der Hefe-Zwei-Hybrid-Test sind bei Membranproteinen weniger wirksam.
- AVEXIS wurde entwickelt, um diese Herausforderungen mithilfe einer rekombinanten Proteinbibliothek zu bewältigen.
Zweck der Studie
- Um neuartige extrazelluläre Proteinwechselwirkungen zu entdecken.
- Um die Kommunikationsprozesse zwischen Zellen zu verstehen.
- Um Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen zu identifizieren, die für biologische Prozesse relevant sind.
Verwendete Methoden
- Erstellung einer rekombinanten Proteinbibliothek extrazellulärer Rezeptorregionen.
- Expression von Proteinen in Säugerzellen zur korrekten posttranslationalen Modifikation.
- Normalisierung von Bait- und Prey-Proteinen zur Verringerung von Falsch-positiven Ergebnissen.
- Screening auf Wechselwirkungen mittels Mikrotiterplatten und enzymatischer Detektion.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von Bindungspartnern für verschiedene Rezeptoren der Zelloberfläche.
- Nachweis der Wirksamkeit von AVEXIS bei der Detektion schwacher Wechselwirkungen.
- Erkenntnisse über zelluläre Verhaltensweisen, die durch Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen beeinflusst werden.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen.
Schlussfolgerungen
- AVEXIS bietet eine robuste Plattform zur Untersuchung von extrazellulären Proteinwechselwirkungen.
- Diese Methode kann unser Verständnis der zellulären Kommunikation erheblich voranbringen.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Erforschung von Wechselwirkungen in der Entwicklungsbiologie umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der Nachweis von niederaffinen, extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen bleibt eine entscheidende Engstelle bei der Zielstrukturvalidierung für die Entwicklung von Biologika und Zelltherapien. AVEXIS ermöglicht ein skalierbares Screening transiente Wechselwirkungen (t1/2 ≤ 0,1 s) mit geringen Falsch-positiv-Raten und unterstützt direkt die mechanistische Entschärfung von extrazellulären Zielstrukturen. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem biologisch relevante Wechselwirkungen identifiziert werden, die mit herkömmlichen Hochdurchsatzmethoden übersehen werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Nachweis direkter extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen membranverankerten Rezeptoren und Liganden.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch systematisches Screening rekombinanter Ektodomänen-Bibliotheken im Mikrotiterplattenformat.
- Prädiktiver Wert: Erhöht die Zuversicht bei der Zielstrukturauswahl, indem Wechselwirkungen mit physiologischer Relevanz identifiziert werden, auch bei schwacher monomerer Affinität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt normalisiertes biotinyliertes Bait- und pentameres enzymmarkiertes Prey-Protein, das für das Hochdurchsatz-Screening von Wechselwirkungen geeignet ist.
- Reproduzierbarkeit: Die Normalisierung der Expressionsniveaus von Bait und Prey verringert falsch-positive Ergebnisse und ermöglicht eine konsistente Detektion über mehrere Screening-Durchläufe hinweg.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Mikrotiterplattenformaten, wodurch nach der Bibliotheksvorbereitung Tausende von Wechselwirkungen pro Tag untersucht werden können.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Identifiziert Rezeptor-Ligand-Paare, die an zellulären Erkennungsprozessen im Zusammenhang mit der Entwicklungsbiologie und dem Gewebe-Homeostase beteiligt sind.
- Mechanistische Ent风险minimierung: Bestätigt direkte binäre Wechselwirkungen, die wechselseitig und wiederholt auftreten können, und stützt damit das Vertrauen in das Zielmolekül vor präklinischen Investitionen.
- Biomarker-Ausrichtung: Die detektierten Wechselwirkungen können Biomarker-Strategien unterstützen, wenn sie mit zellulären Verhaltensweisen wie der Myozytenfusion oder der Neuralleistenbildung verknüpft sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
AVEXIS ist in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur Leadoptimierung integriert, insbesondere für extrazelluläre Zielstrukturen, bei denen die Interaktionsstärke konventionelle Screening-Verfahren begrenzt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Detektion direkter extrazellulärer Wechselwirkungen, die aufgrund geringer Affinität sonst übersehen werden könnten.
- Screening: Bietet assaysbereite, normalisierte Proteinbibliotheken, die reproduzierbare, quantitative Nachweise von Wechselwirkungen im Hochdurchsatzformat ermöglichen.
- Analytik: Ermöglicht farbmetrische Auswertungen mittels β-Lactamase-Hydrolyse, quantifizierbar bei 485 nm, und damit die Bewertung von Wechselwirkungen sowie die Priorisierung von Hits.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit präklinischer Relevanz, indem Wechselwirkungen identifiziert werden, die zelluläre Kommunikation und Erkennung steuern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening extrazellulärer Interaktome über mehrere Zielproteinfamilien und Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Entlastung extrazellulärer Zielstrukturen durch Nachweis von schwachen, biologisch relevanten Wechselwirkungen.
- Operationaler Wert: Standardisierte Proteinausprägung, Normalisierung und Detektion verringern Variabilität und erhöhen die Zuverlässigkeit von Screenings.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem Wechselwirkungsnetzwerke frühzeitig aufgedeckt werden und so die Ausschaltung in späteren Stadien reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validiertem extrazellulärem Interaktionspotenzial.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultivierung von Säugetierzellen, der Herstellung rekombinanter Proteine und enzymatischen Nachweisverfahren.
- Abhängig von mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten, Plattenlesegeräten und Infrastruktur zur Normalisierung (Dialyse, Konzentrierung).
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Herstellung der Proteinbibliothek, den Normalisierungsschwellenwerten und den Protokollen zur Validierung von Hits.
- Anwendbar auf Typ I, Typ II, GPI-verankerte Rezeptoren und sekretierte Proteine; nicht geeignet für mehrfachmembranständige Proteine wie Ionenkanäle.
- Praktische Einschränkung: Die Herstellung der Bibliothek ist ressourcenintensiv; die Effizienz des Screenings hängt von einer konsistenten Normalisierung von Bait- und Prey-Proteinen ab.
