Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

In diesem Video wird ein Verfahren zur Verfolgung von T-Zell-Rezeptor-Signalereignissen mithilfe der simultanen Aufnahme in zwei Kanälen beschrieben. Zunächst werden T-Zellen mittels Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie oder TIRF-Mikroskopie mit einem Plasmid transfiziert, das GFP-markiertes ZAP-70 kodiert. Eine glasgestützte Lipiddoppelschicht, die peptidverankerte Lipide enthält, sowie MHC-Komplexe, Adhäsionsmoleküle und kostimulatorische Moleküle werden hergestellt.

Die mit ZAP 70 transfizierten T-Zellen werden hinzugefügt, sobald die T-Zell-Rezeptoren durch Peptid-MHC-Komplexe aktiviert werden. Die mit dem T-Zell-Rezeptor assoziierten CD3-Ketten werden durch die SARC-Familienkinase LCK phosphoryliert, und die Kinase ZAP 70 wird aus dem Cytoplasma rekrutiert. Anschließend werden die T-Zell-Rezeptoren fluoreszenzmakiert, und es wird eine Bildgebung durchgeführt, bei der die Zellen in einem Medium mit niedrigerem Brechungsindex als das Deckglas liegen und mit einem Laserstrahl unter einem Winkel beleuchtet werden, der Totalreflexion bewirkt.

Dadurch entsteht an der Grenzfläche zwischen Glas und Wasser eine evaneszente Welle, die exponentiell in das Medium eindringt und eine Eindringtiefe von 100 bis 200 Nanometern ermöglicht. Daher werden nur Fluorophore in der Plasmamembran oder in unmittelbarer Nähe dazu angeregt. Die Analyse der entstandenen Bilder zeigt, dass die Signalübertragung in mikroskopischen T-Zell-Rezeptor-Clustern stattfindet.

Der Hauptvorteil der Rasenmikroskopie oder der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass man eine bessere Auflösung erhält, wodurch Signalkomplexe oder Signalcluster wie TCR-Mikrocluster leicht sichtbar gemacht werden können. Travis Crites und Chen, beide Postdoktoranden in meinem Labor, werden demonstrieren, wie man primäre Maus-T-Zellen mittels der Maxi-Nukleofektions-Technologie transfiziert und anschließend mittels Total-Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie oder TURF-M bildet, wobei die Zellen mit einer Glasoberfläche stimuliert werden, die eine Lipid-Doppelschicht mit Antigen enthält.

Diese Methode wurde umfassend zur Untersuchung der Signalübertragung in verschiedenen Immunzellen eingesetzt, einschließlich T-Zellen, B-Zellen, natürlichen Killerzellen und Mastzellen. Die Methode ist breit anwendbar und kann zur Untersuchung der meisten Rezeptorsysteme in Säugetierzellen verwendet werden, insbesondere wenn die Signalübertragung in Clustern erfolgt. Personen, die neu in der Methode sind, könnten anfangs Schwierigkeiten haben, da T-Zellen sehr schwer zu transfectieren sind.

Zusätzlich ist eine präzise Abstimmung erforderlich, damit die T-Zell-Vitalität und Transfektions-Effizienz, die Qualität der Bilar-Präparate sowie die Ausrichtung des Mikroskops den Anforderungen genügen. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, entweder naive oder in vitro aktivierte primäre T-Zellen mit Expressionsplasmiden zu transfizieren, die kodierende Signalmoleküle enthalten, die mit GFP markiert sind, und zwar unter Verwendung eines AM Maxa Mouse T-Cell Nucleo Effector Kits. Alle in dieser Studie verwendeten T-Zellen exprimierten den A-N-D-T-C-R, der das an das MHC-Molekül IE von K gebundene MCC-Peptid erkennt. Das hier gezeigte Transfektionsverfahren wird gemäß den Herstellerempfehlungen durchgeführt.

Es werden jedoch einige Tipps gegeben, die die Vitalität der T-Zellen nach der Transfektion fördern. Sowohl die Vitalität als auch die Transfektionseffizienz sind bei in vitro aktivierten T-Zellen höher als bei naiven Zellen; daher verwendet dieses Protokoll vor Versuchsbeginn in vitro aktivierte T-Zellen. Bereiten Sie für jede Transfektion zwei Milliliter ergänztes T-Zell-Medium vor, indem Sie 1,9 Milliliter des im Kit enthaltenen Mediums, 20 Mikroliter Komponente A, 20 Mikroliter Komponente B und 100 Mikroliter fetalen Kälberserum in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen kombinieren.

Übertragen Sie zwei Milliliter Medium in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Stellen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C, damit sich das Medium anpassen kann. Zelltod tritt auf, wenn transfizierte Zellen in kaltem Medium oder in Medium mit einem pH-Wert abweichend von 7,2 resuspendiert werden. Um die Transfektionsmischung herzustellen, mischen Sie 82 µL Maus-T-Zell-Nukleo-Effektor-Lösung mit 18 µL Supplement zwei und fünf µg endotoxinfreier Plasmid-DNA mit einer Konzentration von nicht weniger als 0,5 µg/µL durch vorsichtiges Antippen gründlich.

Überführen Sie fünf bis zehn Millionen Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 75 × g. Entfernen Sie mithilfe eines Vakuumaspirators so viel wie möglich vom Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig im Transfektionsgemisch, wobei Sie das Zellpellet langsam drei bis vier Mal ansaugen, bis keine größeren Zellklumpen mehr vorhanden sind. Übertragen Sie die Suspension vorsichtig mit einer Pipette in eine zertifizierte Amaxa-Viete, wobei sicherzustellen ist, dass keine Bläschen enthalten sind.

Schließen Sie das qve, wählen Sie das nukleäre Effektor-Programm X 0 0 1 am Nukleo-Effektor-Gerät aus. Führen Sie das vete in den Q-vete-Halter ein und drücken Sie die Taste, um das ausgewählte Programm anzuwenden. Überführen Sie anschließend das vete und das vorab äquilibrierte Kulturmedium unverzüglich in den Sicherheitswerkbank.

Unter Verwendung der beigefügten Plastikpipette etwa 500 Mikroliter des vorgewässerten Mediums in die Vertiefung geben. Anschließend die Zellsuspension tropfenweise zum Medium in der Platte hinzufügen.

Die Zellen für vier Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, um eine schwache Expression der mit GFP markierten Proteine zu ermöglichen und das Auftreten von Artefakten durch Überexpression zu minimieren. In diesem Abschnitt wird eine Methode zur Justage des Mikroskops für die simultane Zweikanal-Aufnahme beschrieben, bevor alle Komponenten des Mikroskops eingeschaltet werden. Schalten Sie den Computer und die Software ein.

Danach sicherstellen, dass alle Hardware-Komponenten von der Software erkannt werden. Da die Software ohne Fehlermeldungen startet, wurden alle Komponenten erkannt. Ein Mikroliter Sub-Resolution verdünnen.

Die Flores-Bright-Multi-Fluoreszenz-Mikrokügelchen in zwei Milliliter PBS geben, um sie als Kollokalisierungsstandard zu verwenden. Anschließend 0,25 Milliliter der Mikrokügelchen-Suspension in jede Vertiefung eines achtbrüchigen Lab-Tech-Kammernobjektträgers hinzufügen. Das Kammersystem auf die Plattform über dem Objektiv stellen.

Bringen Sie dann die Beads, die das Licht absorbieren, mit dem Glas auf der Live-Vorschau in den Fokus. Im linken Fensterbereich ist der Kanal dargestellt, in dem die GFP-transfizierten Zellen sichtbar sein werden. Im rechten Fensterbereich werden während der Live-Cell-Bildgebungsexperimente markierte TCR sichtbar sein.

Stellen Sie mithilfe der Y-Ausrichtung des XY-, Z-Faserankopplungsmoduls die Position des Laserstrahls so ein, dass der Strahl aus dem Objektiv austritt und an die Decke projiziert wird. Dies ist wichtig, wenn sich das Objektiv in der Position befindet, in der die Glasoberfläche scharfgestellt ist. Wenn der Strahl an der Decke gestreut erscheint, ist der Strahl nicht kollimiert.

Stellen Sie den Z-Mikrometer ein, um eine vollständige Kollimation für jede der im Experiment verwendeten Laserlinien zu erreichen. Anschließend stellen Sie mithilfe eines Laserleistungsmessgeräts die Laserleistung für jeden Kanal auf 20 bis 30 Mikrowatt ein. T-Zellen sind äußerst empfindlich gegenüber Laserstrahlung, weshalb die Beleuchtung auf insgesamt 50 Mikrowatt begrenzt ist.

Als Nächstes den Winkel für das Rasenstück einstellen. Den Y-Ausrichtungsmikrometer am Faseranfang drehen, um den Strahl so lange von der Decke wegzubewegen, bis sein Winkel bezüglich der optischen Achse des Objektivs 90 Grad annähert.

Sobald der Grenzwinkel für totale interne Reflexion erreicht ist, verlässt das Laserlicht das Objektiv nicht mehr. Um zu beurteilen, ob eine gute Turf-Ausrichtung erreicht wurde, fokussieren Sie durch die Ebene des Deckglases nach oben und unten. Beachten Sie hierbei, dass beim Aus-dem-Fokus-Bewegen der an die Oberfläche adsorbierten Perlen viele Perlen in Lösung schwebend sichtbar sind. Um eine gute Turf-Ausrichtung zu erreichen, ist es notwendig, den Winkel des Strahls bezüglich des Objektivs zu erhöhen.

Wenn der Winkel des Strahls erhöht wird, beginnen die nahe der Oberfläche schwimmenden Kügelchen zu verschwinden, und die an der Grenzfläche adsorbierten Kügelchen nehmen an Intensität zu. Wenn nun die an der Grenzfläche adsorbierten Kügelchen aus dem Fokus gebracht werden, sind keine in der Lösung schwimmenden Kügelchen mehr sichtbar. Zu diesem Zeitpunkt ist der Aufbau korrekt ausgerichtet, da nur die an dem Deckglas adsorbierten Kügelchen im Fokus sein können.

Danach, um die roten und grünen fluoreszierenden Kanäle zueinander auszurichten, fokussieren Sie sich auf die Perlen und vergleichen Sie die Position erkennbarer Merkmale in den Bildern beider Kanäle. Mithilfe der X- und Y-Feintriebschrauben an einem der Kamerastative bringen Sie die relative Position der Perlen so nah wie möglich aneinander heran. Achten Sie dabei auf die helle Perle im linken unteren Quadranten beider Bilder, um die räumliche Ausrichtung zwischen den beiden Kanälen sicherzustellen.

Dieses Merkmal wird in beiden Bildern an derselben relativen Position dargestellt. Erfassen und speichern Sie das Bild aus beiden Kanälen. Diese Bilder werden als Kollokalisierungsstandard verwendet, um die beiden Kanäle auszurichten.

Ein Beispiel dieser Ausrichtung ist hier vor der Ausrichtung zu sehen. Einer der Kanäle ist gegenüber dem anderen gedreht, wie in diesem Bild gezeigt, in dem die Bilder der beiden Kanäle der subauflösenden Perlen überlagert sind. Nach den Anpassungen sind die Bilder wie hier gezeigt ausgerichtet.

Die Qualität der Ausrichtung kann weiter überprüft werden, indem Bilder von GFP-transfizierten lebenden Zellen verglichen werden. Achten Sie darauf, wie die Laila-Podiums der beiden Kanäle perfekt übereinanderliegen, nachdem die beiden Bilder mithilfe der Kalibrierung, die mit fluoreszierenden Mikroperlen erstellt wurde, ausgerichtet wurden.

Nachdem das Mikroskop eingerichtet ist, werden Flusskammern vorbereitet, die auf Glas unterstützte Lipiddoppelschichten enthalten, auf denen Antigen präsentiert wird, und es wird turf M durchgeführt, um TRANSFEKTIERTE T-Zellen zu visualisieren, die mit dem Substrat interagieren. Gemäß der von Ana und Dustin beschriebenen Anleitung wird eine Flusskammer mit planaren Lipiddoppelschichten auf einem Glasdeckchen, das NI NTA-Lipide, das Adhäsionsmolekül ICAM-1 sowie Peptid-MHC-Komplexe enthält, zusammengestellt. MCC-beladene IEFK werden über Histidin-Tags in die Doppelschicht eingebaut.

Das kostimulatorische Molekül CD 80 wird eingebaut. Mithilfe eines GPI-Ankers wird die Flusszelle auf dem Mikroskoptisch positioniert und durch Befestigung der Kammer an einer Adapterplatte auf dem Mikroskoptisch mit einer Spannleiste fixiert, um sie zu stabilisieren. Anschließend wird das vom Hersteller mitgelieferte Heizelement an der Flusszelle angebracht, um deren Temperatur zu regulieren.

Positionieren Sie das Objektiv auf einer Doppelschicht und fokussieren Sie die Ebene der Doppelschicht, um das Objektiv und die Durchflusszelle zu erwärmen. Schalten Sie die Heizungen der Durchflusszelle und des Objektivs ein, um die Kammer auf 37 Grad Celsius aufzuheizen. Nach vierstündiger Inkubation überführen Sie die durchtrennten T-Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren mit einer Geschwindigkeit von 80 × g. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 µL H-B-S-B-S-A-Puffer. Geben Sie anschließend H 57 FAB oder H 57 single chain variable fragment hinzu, um den TCR zu markieren, und zwar mit einer Endkonzentration von 10 µg/mL für FAB bzw. 20 µg/mL für das single chain variable fragment.

Überführen Sie die Zellen in ein fünf Milliliter fassendes FACS-Röhrchen. Danach injizieren Sie die Zellen mithilfe einer Ein-Milliliter-Spritze mit Luer-Anschluss über ein Dreiwegventil in die Durchflusskammer. Richten Sie die Bildgebungsbedingungen so ein, dass die Live-Aufnahme mit zwei Kanälen eine Echtzeitvorschau der TCR- und GFP-Kanäle zeigt, und suchen Sie ein Feld mit transfizierten Zellen.

Aufgrund von Intensitätsunterschieden zwischen TCR und GFP muss die Skalierung der Bilder möglicherweise in Echtzeit angepasst werden, damit die Zellen in beiden Kanälen sichtbar sind. Wie hier dargestellt, bestätigen Sie die Beleuchtung des Feldes, indem Sie die Fokusebene auf die Glasoberfläche anheben, um eine seitliche Membranfärbung zu erkennen. Wenn die seitlichen Membranen nicht scharf gestellt werden können, ist die Ausrichtung des Feldes korrekt.

In dieser Live-Vorschau ist eine Färbung der lateralen Membran sowohl in der Ebene der Deckglasoberfläche als auch sichtbar, wenn das Deckglas aus dem Fokus bewegt wird, um die Mikroskopeinstellung auf eine optimale Turf-Ausrichtung zu bringen. Der Winkel des Lasers in Bezug auf das Objektiv wird vergrößert und die laterale Membran gerät aus dem Fokus. Beginnen Sie mit der Aufnahme einzelner Bilder und Zeitrafferserien mit einem Intervall von 10 Sekunden.

Die Zellen wurden fünf Minuten lang auf Glas geträgerten und INTA-Bilagen inkubiert, die sechs Moleküle pro Quadratmikrometer Peptid-beladenes, histidinmarkiertes IEFK, 100 Moleküle pro Quadratmikrometer mit Alexa 647 konjugiertes, histidinmarkiertes ICAM-1 sowie 100 Moleküle pro Quadratmikrometer GPI-verankertes CD80 enthielten. Die simultane zweikanalige Aufnahme erfolgte mittels TIRF-Mikroskopie unter kontinuierlicher Anwesenheit des mit Alexa 546 konjugierten H57-Fab-Fragments.

Zur Färbung der TCR-Zellen wurden diese bis zu einer Stunde nach dem ersten Kontakt mit dem Bilayer abgebildet. Die Anzahl der ZAP-70-Cluster pro Zelle wurde mithilfe einer automatisierten Software zur Clusterzählung analysiert. In jedem Fall wurden mindestens 40 Zellen analysiert.

Die beladenen Peptide sind im Einleger angegeben. ICAM-1 bezieht sich auf Zellen auf Doppelschichten, die 100 Moleküle pro Quadratmikrometer von Alexa 647-konjugiertem His-markiertem ICAM-1 enthalten, wie in der Abbildung dargestellt. Eine ZAP-70-abhängige Signalgebung tritt in TCR-Mikroclustern auf und nur als Reaktion auf agonistische Liganden, wie in diesem Film gezeigt, der mit 10 Sekunden pro Einzelbild aufgenommen wurde.

Die TCR-Signalübertragung als Reaktion auf agonistische Peptide wird aufrechterhalten durch die kontinuierliche Bildung von TCR-Mikroclustern im peripheren Bereich der Kontaktzone, die ZAP-70 rekrutieren. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre T-Zellen mittels einer maxa-nuklearen Transfektionstechnologie transfiziert und die Rekrutierung von GFPT-Signalproteinen zu TCR-Mikroclustern mittels Turf-Mikroskopie korrekt abbildet. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von sieben Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets sehr vorsichtig mit den primären Zellen umzugehen. Je gesünder die Zellen in jedem Schritt des Experiments sind, desto höher wird die Transfektionseffizienz sein und desto mehr Zellen werden Sie bei der Bildgebung erfassen können. T-Zellen sind stark beweglich, wodurch die aufeinanderfolgende Aufnahme der TCR- und GFP-Kanäle dazu führt, dass die beiden Bilder aufgrund der Bewegung von TCR-Mikroclustern und der Zellen nicht perfekt übereinstimmen.

Um dieses Problem zu lösen, haben wir das Dual-Channel-Simultanerfassungs-Turf-Mikroskop entwickelt.